Роль апоптоза в развитии, функционировании и нарушении функции яичников

J.L.Tilly, J.K.Pru, B.R.Rueda

The Ovary, 2004, Ch. 19, pp 321-345

Абстракт

Апоптоз - форма клеточной гибели, необходимая для удаления поврежденных и ненужных клеток из организма, играет важную роль почти во всех аспектах развития и функционирования яичников животных и человека. За годы изучения лабораторных моделей и человеческих тканей накопились сведения о гормонах, генах и регуляторных механизмах апоптоза соматических клеток и предшественниц половых, что привело к развитию новых направлений медицины, направленных на улучшение репродуктивного здоровья женщин. Кроме того был достигнут значительный прогресс в изучении роли апоптоза в развитии повреждений яичников за счет факторов окружающей среды, лекарств и несчастных случаев. Большинство опубликованных данных о регуляции апоптоза в яичниках основаны на сравнительном анализе экспрессии генов или на изучении действия отдельных агентов на изолированную культуру яичниковых клеток in vitro. В настоящей главе представлен обзор данных, касающихся программированной клеточной гибели и ее регуляции.

Введение

Сегодня хорошо известно, что эмбрион использует апоптоз как часть своей программы развития для удаления зародышевых структур и построения новых органов. Апоптоз продолжает играть важную роль в постнатальной жизни, поддерживая тканевой гомеостаз и удаляя поврежденные и ненужные клетки. Во многих тканях взрослого организма, таких как соединительная или мышечная, частота апоптоза в нормальных условиях минимальна. Однако клетки в этих тканях могут запускать программу программированной гибели под воздействием специфических токсинов внешней среды, химиотерапии, радиации, окислительного стресса, гипоксии или воспаления. Другие ткани, в частности те, что состоят из гемопоэтических и эпителиальных клеток, имеют более высокую скорость клеточных обновлений, при которых многократные митозы уравновешиваются адекватным уровнем апоптоза. Такие ткани содержатся в органах иммунной системы, тонкой кишке, матке и яичниках.

Описано не менее 6 форм клеточной гибели под влиянием условий внешней и внутренней среды: апоптоз, автохизис, анойкиз, параптоз, автофагоцитоз, некроз. В этой главе сфокусировано внимание в основном на апоптозе, поскольку эта форма клеточной гибели наиболее часто встречается в яичниках как в физиологических, так и во многих патологических ситуациях. Мы уделили большее внимание механизмам генетической регуляции и сигнальной передачи апоптоза, чем морфологическим особенностям клеток в период умирания.

Итак, в следующих частях этой главы собраны известные сведения о регуляции апоптоза в яичниках в основном позвоночных. Однако некоторые сведения даны о беспозвоночных, в частности - мушке дрозофилле, являющейся традиционным объектов генетических исследований, в том числе и исследований апоптоза.

ОБЩАЯ КОНЦЕПЦИЯ АПОПТОЗА

Стимулы и сигнальная передача программы апоптоза

Внеклеточные сигналы, отвечающие за инициацию апоптоза в различных клетках могут быть физиологическими или патологическими. Например, при нормальном развитии и функционировании ткани, подавление ростовых факторов, гарантирующих выживание, или присутствие «лигандов клеточной гибели» являются механизмами избавления организма от ненужных и поврежденных клеток путем апоптоза. Однако множество внешних импульсов, таких как химиотерапия, радиация, повышенное окисление, токсины вызывают повреждение ткани также путем неадекватной активации апоптоза. Т.о. существует множество сигналов и сигнальных путей активации апоптоза, они различны для разных клеточных типов или для одного типа, но разной стадии жизненного цикла клеток.

Рецепторы и лиганды клеточной гибели

«Рецепторы клеточной гибели», расположенные на поверхности клетки, представляют собой подсемейство в составе 26-членного семейства рецепторов TNF (фактора некроза опухоли), для активации апоптоза неоходим цитоплазматический домен. Это семейство у млекопитающих включает рецептор-1 TNF-альфа (TNFRI), р75-нейротрофин-рецептор (p75 NTR), Fas, рецептор TNF-альфа-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда (DR4), рецептор клеточной гибели-3 (DR3), - 5(DR5), -6 (DR6). В большинстве случаев активация рецепторов клеточной гибели с помощью их лигандов вызывает тримеризацию рецептора и образование сигнального комплекса, индуцирующего апоптоз (DISC) на цитоплазматической поверхности клеточной мембраны. Затем домены тримеризованного рецептора координируют взаимодействие цитоплазматического участка каждого рецептора с адаптером FADD (Fas-ассоциированный, содержащий домен клеточной гибели протеин). Fas часто вовлекает зимогенную форму проапоптотической цистеин-протеазы - каспазы-8, для дополнения DISC. Автопроцессинг прокаспазы-8 в ее активную форму приводит к быстрому инициированию клеточной гибели.

Образование DISC, инициирующего процесс апоптоза, происходит по двум механизмам. В клетках 1 типа генерируется достаточный уровень активированной каспазы-8, что позволяет активировать другие прокаспазные ферменты, функционирующие как конечные эффекторы апоптоза (рис. 19.1). В клетках 2 типа апоптоз, инициированный низким уровнем каспазы-8, активированной комплексом DISC, усиливается за счет дестабилизации митохондрий, с участием каспаза-8 - опосредованной активацией проапоптотического Bid-протеина (рис. 19.1). Тримеризованные рецепторы клеточной гибели подвергаются олигомеризации и располагаются на одном полюсе клеточной поверхности. Этот процесс, «образование шапки», возможно опосредуется церамидом, и облегчает аутокатализ прокаспазы-8. Несмотря на то, что активация рецепторов гибели служит первичным механизмом индукции апоптоза у позвоночных как в физиологических, так и в патологических условиях, у С.elegans не было идентифицировано лигандов или рецепторов суперсемейства TNF. Только недавно был клонирован гомолог TNFRI у дрозофиллы и продемонстрирована его роль как потенциального индуктора апоптоза.

Многие лиганды рецепторов гибели оказывают множественное действие, независимое от апоптоза. Каким образом один лиганд - TNF-альфа - оказывает такой широкий спектр действий, включающий пролиферацию, апоптоз, активацию иммунных клеток, воспаление? Одним объяснением является взаимодействие специфических белков на или рядом с цитоплазматическими доменами рецепторов гибели, которое вызывает разное биологическое действие лиганд-активированного рецептора. Например, адаптерный белок TRAF2 (для TNF-альфа- рецептор-ассоциированного фактора 2) вызывает сигнальную трансдукцию TNFRI, активируя либо проапоптотический (JNK), либо антипапоптотический (NFkB) пути. Сфингозин-киназа взаимодействует с TRAF-2 в клетках HEK 293T, активируя NFkB, но не JNK. Наличие или отсутствие этого фермента влияет на ответ клетки на TNF-альфа. Конечно сигнальный путь, активируемый TNF-альфа, подвержен влиянию большого количества других сигнальных механизмов, активируемых различными факторами.

Протеинкиназы

Митоген-активируемая протеинкиназа

Связь суперсемейства митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК) с апоптозом отмечается в большом количестве публикаций, причем отмечено как активирование, так и блокирование клеточной гибели. Эта группа белков состоит из трех семейств: внеклеточные сигнальные киназы (антиапоптотические) - ERK, проапоптотические или стресс-активируемые р38 МАРК и проапоптотические или стресс-активируемые JNK. Активация каждого семейства происходит в каскаде фосфорилирования, что в свою очередь приводит к посттрансляционным изменениям молекул-мишеней, изменениям экспрессии генов или обоим изменениям. В настоящей главе внимание сфокусировано на семействе JNK и его роли в качестве проксимального медиатора апоптоза. Все типы клеток, изучаемых до сих пор, - от дрожжевых до человеческих - отвечают на различные формы стресса путем активации этого класса сигнальных белков. Однако необходимо отметить, что роль JNK в активации апоптоза зависит от типа клетки и вида стимула. Было предположено, что влияние активации JNK на апоптоз зависит от активности других сигнальных путей, например ERK или NFkB-опосредованных, что позволяет предположить, что активация JNK облегчает, но не обязательно инициирует процесс апоптоза.

На сегодняшний день у млекопитающих открыто 3 гена, кодирующих 10 вариантов мРНК для JNK, - такая избыточность затрудняет изолированное изучение влияния JNK только на апоптоз. Кроме того, киназы, фосфорилирующие и таким образом активирующие JNK, тоже весьма разнообразны. Каспаза катализирует расщепление регулирующих JNK-путь киназ, что усиливает апоптоз. Ассоциация адаптерного протеина Daxx с активированным Fas также инициирует активацию JNK. Однако значение этих событий для апоптоза, т.е. требовала или нет активация апоптоза в этой модели участия JNK - достоверно не выяснено. Эксперименты на моделях с отсутствием отдельных генов JNK не смогли показать дефектов в процессе апоптоза. Однако мыши с отсутствием и JNK1 и JNK2 погибали в эмбриогенезе из-за нарушений нейронального апоптоза. Эмбриональные мышиные фибробласты (MEF) с отсутствием JNK1 и JNK2 резистентны к стресс-индуцируемому, но не опосредованному через клеточные рецепторы гибели апоптозу. Было показано, что такие MEF не способны высвобождать цитохром с из дестабилизированных митохондрий - необходимый шаг в стресс-индуцируемом апоптозе, который можно обойти при 1 типе апоптоза, индуцированном рецепторами клеточной гибели.

Более ясная картина роли JNK в активации апоптоза наблюдается у двукрылых насекомых, у которых JNK-сигнальный путь необходим для апоптоза, опосредованного через рецепторы клеточной гибели. Этот вывод обнаружился после недавнего клонирования аналога TNFRI у дрозофиллы - Eiger. В отличие от своих аналогов у млекопитающих, лиганд-активированный Eiger не вызывает образования DISC, но необходим для активации апоптоза, опосредованного через рецепторы гибели, прямым путем, не требующим изменения митохондрий. Однако Eiger-индуцированная клеточная гибель зависит от других компонентов механизма апоптоза у дрозофиллы (например, каспаза-9 - подобная протеаза, Dronc, Apaf-1-подобный белок, Dark/Dapaf-1). В 2002 Moreno et al продемонстрировали, что сигнальный путь JNK ведет к активации Dronc за счет подавления функции класса белков - т.н. протеинов-ингибиторов апоптоза (IAP) (рис. 19.1). Eiger/JNK путь необходим для активации транскрипции двух ключевых генов апоптоза у Двукрылых - hid и reaper. Как описано на рис. 19.1, Hid и Reaper связывают и блокируют функцию IAP дрозофиллы, открывая путь апоптозу. Остается выяснить, сохраняется ли этот прямой пусть JNK у более организованных животных, млекопитающих.

Фосфатдилинозитол 3’-киназа (PI3-K) и Akt

Клеточный сигнальный механизм выживания, связанный либо с рецепторами ростовых факторов (например рецептор тирозин-киназы), либо с другими антиапоптотическими сигнальными механизмами (протеинкиназа А, NFkB). Большое число исследований подтвердило, что PI3-K активируется путем экспрессии на цитоплазматической поверхности плазматической мембраны, что ведет к лигандной активации рецепторов ростовых факторов, или путем прямого взаимодействия с Ras протоонкогеном. Активированная PI3-K катализирует образование 3’-фосфорилированных фосфоинозитидов из фосфолипидов клеточной мембраны. Эти липидные молекулы затем связываются и таким образом активируют серин\треонин-киназу, 3’-фосфоинозитид-зависимую киназу-1 (PDK-1), которая является основным ферментом, способным активировать разнообразные киназы, включая Akt. В физиологических условиях активированная ростовыми факторами Akt служит для фосфорилирования белков, поддерживающих основные функции клеток, такие как транспорт и окисление глюкозы. В частности, активация рецептора инсулин-подобного фактора роста-1 (ИПФР-1) его лигандом индуцирует Akt-опосредованное фосфорилирование киназы-3 гликоген-синтетазы. Фосфорилирование переносчика глюкозы (Glut-4) Akt приводит к eго транслокации на клеточную поверхность и утилизации глюкозы. Нарушения Akt-сигнального пути обычно происходят при нарушении гомеостаза и вызывают апоптоз путем блокирования жизненно-необходимых обменных процессов (например легочного дыхания) и активирования компонентов механизма апоптоза. Стресс-индуцированный механизм связан с повреждением клетки или потерей факторов роста - он может ослабить или полностью блокировать Akt-сигнальный механизм. Было продемонстрировано, что различные регуляторы апоптоза зависят от активности Akt на уровнях транскрипции или посттрансляционных изменений. В частности, представители семейства факторов транскрипции Forkhead после фосфорилирования Akt остаются связанными с другими цитозольными белками (14-3-3 протеины). Однако в отсутствии Akt-опосредованного фосфорилирования факторы транскрипции Forkhead могут транслоцироваться в ядро и повышать экспрессию проапоптотических регуляторных генов, таких как лиганд Fas. Другой пример - активность проапоптотического ВН3-протеина, Bad, регулируется его статусом фосфорилирования. В клетках, поддерживаемых достаточным уровнем факторов роста, активация Akt ведет к зависимой от фосфорилирования секвестрации Bad 14-3-3 протеинами. Однако потеря Ask-сигнального пути или повышение фосфатазной активности приводит к высвобождению Bad, делая его свободным для взаимодействия с другими представителями семейства Bcl-2, облегчающего апоптоз. Akt также напрямую взаимодействует с прокаспазой-9. Точный механизм, путем которого каспаза-9 инактивируется из-за фосфорилирования Akt, неизвестен, но предполагается, что каталитическая активность каспазы-9 блокируется напрямую. Участок фосфорилирования Akt (RXRXXS/T) идентифицирован в других белках-регуляторах апоптоза на каждом уровне апоптотического каскада (каспаза-8, Bcl-2, Apaf-1, IAP, каспаза-7).

Апоптоз инициируется, когда клетка подвергается стрессу (отсутствие факторов роста, гипоксия, облучение) или при активации рецепторов клеточной гибели (например Fas). Такие стимулы клеточной гибели усиливаются путем активации большого числа механизмов сигнальной трансдукции, которая приводит к посттрансляционным изменениям или индукции транскрипции BH3-протеинов - внутриклеточный этап чувствительности. Большинство BH3-протеинов (Bim, Bad, PUMA, Nix; EGL-1 аналоги) олигомеризуются с антиапоптотическими Bcl-2-подобными протеинами (CED-9 аналоги), освобождая проапоптотические мультидоменные Bcl-2 белки (Bax-подобные, Drob1-аналоги) для вхождения в митохондрии после реолигомеризации. Некоторые ВН3-протеины (например, Bid) напрямую олигомеризуются с Bax-подобными протеинами для облегчения вхождения в митохондрии. Митохондриальные взаимодействия затем приводят к высвобождению множества факторов апоптоза, включая Smac/DIABLO, Cyto c (цитохром с), Endo-G (эндонуклеаза G), фактор индукции апоптоза (AIF) и Omi в цитозоль. Smac/DIABLO (Hid, Grim и Reaper) нейрализуют IAP, Endo-G расщепляет ДНК, AIF и Omi гидролизуют белки и\или катализируют аспад ДНК. Освобождение цитохрома с облегчает образование апоптосомы, многомерного белкового комплекса, состоящего из Apaf-1 (CED-4/Dapaf-1 аналог) и каспазы 9. В отсутствие летальных стимулов IAP блокируют образование апоптосомы и активность каспазы-3. Если апоптосома формируется, она активирует эффекторные прокаспазы (CED-3 и drICE аналоги), такие как прокаспаза-3, образуя активные ферменты, расщепляющие белки-мишени в клетках, способствуя апоптозу. У позвоночных существует 2 модели, объясняющие каким образом эффекторные каспазы активируются после связывания рецепторов клеточной гибели. В некоторых клетках процессы в митохондриях являются этапом, усиливающим распад клетки путем формирования апоптосомы (2 тип), а в других (тип 1) этого этапа нет.

Сфингомиелиновый сигнальный путь

Поскольку сфинголипиды традиционно рассматриваются как структурные компоненты клеточной мембраны, их метаболизм, приводящий к образованию церамида, сфингозина и сфингозин-1-фосфата (S1P), участвует в регуляции различных клеточных процессов. Церамид, вторичный мессенджер остановки клеточного цикла и апоптоза, может образовываться в клетках из сфингомиелина клеточной мембраны под воздействием сфингомиелиназы или путем синтеза de novo. Церамид в дальнейшем может изменяться под воздействием церамидаз в сфингозин, вторичный мессенджер, способный подавлять активность протеинкиназы С и активировать апоптоз. В отличие от проапоптотических свойств церамида и сфингозина, S1P, образующийся при фосфорилировании сфингозина сфингозинкиназой, признан сигнальной молекулой для клеточной пролиферации, роста и выживания.

Идентифицированы некоторые механизмы, за счет которых накопление церамида ведет к апоптозу или остановке роста, в двух из них задействованы взаимодействия между МАРК и PI3-K/Akt - сигнальными путями. Например, церамид, вырабатываемый в ответ на различные стрессовые сигналы, такие как цитокиновые атаки или радиация, активирует стресс-активированная протеинкиназа (SAPK)/JNK-каскад. Церамид может также напрямую противодействовать PI3-K/Akt сигнальному муханизму выживания клетки, возможно путем активации фосфатазы или путем функциональной секвестрации антиапоптотических киназ в липидных микродоменах. Церамид также индуцирует протеолитическую деградацию Akt. Как обсуждалось ранее, потеря PI3-K/Akt-активности в результате всех этих эффектов церамида может привести к снижению фосфорилирования и активации некоторых ключевых регуляторов апоптоза. Избыточная экспрессия Akt может снижать продукцию церамида и блокировать церамид-индуцированный апоптоз.

Проапоптотическое действие церамида может также затронуть митохондрии путем дестабилизации их мембран или высвобождения апоптогенных факторов из их органелл. Церамид может усилить Bax-индуцированню проницаемость мембраны и привести к формированию пор, достаточных по размеру для высвобождения митохондриальных ионов и даже небольших белков, таких как цитохром с. Хотя эти неспецифические церамидные поры возможно прямо не влияют на высвобождение цитохрома с, они могут повышать проницаемость наружной мембраны митохондрий во время апоптоза. Cremesti et al продемонстрировали, что церамид, образующийся во внешнем слое клеточной мембраны, вызывает полярное перераспределение и олигомеризацию («образование шапки») рецептора Fas. В этом случае на цитоплазматической поверхности клетки формируется суперкаталитический домен, могущий служить усиливающим этапом, необходимым для Fas-опосредованного апоптоза.

Хотя церамид - это важная составляющая апоптотического ответа на стресс, он также служит в качестве предшественника синтеза антиапоптотического сигнального липида, S1P. Метаболическая конверсия церамида в S1P служит молекулярным переключателем, снижающим восприимчивость клетки к летальным факторам. Несмотря на наши представления о том, как церамид провоцирует развитие апоптоза, сравнительно немного известно о механизмах действия S1P. Понимание осложнено также таким фактом, что этот липид может служить сигналом как внутри, так и снаружи клетки. Снаружи S1P служит лигандом для рецепторов гена дифференцировки эндотелия (EDG) - семейства G-протеин парных рецепторов, экспрессирующихся на плазматической мембране большинства клеток. 5 EDG-рецепторов, связывающих S1P с наибольшей аффинностью, идентифицированы: EDG1/S1P1, EDG5/S1P2, EDG3/S1P3, EDG6/S1P4, EDG8/S1P5. С другой стороны S1P известен как внутриклеточный вторичный мессенджер, блокирующий апоптоз. Хотя имеется немного информации относительно механизмов этого последнего эффекта, некоторые факты известны. Во-первых, S1P взаимодействует (или напрямую активирует) с антиапоптотическими сигнальными путями (NFkB, ERK). Во-вторых, введение S1P в лимфоциты снижает экспрессию представителя проапоптотического семейства Bcl-2 - Bax, блокируя апоптоз. В-третьих, S1P может оказывать свое антиапоптотическое действие, предотвращая стресс-индуцированные процессы в митохондриях (например, S1P блокирует высвобождение цитохрома с и Smac/DIABLO из митохондрий, предотвращая каскад каспазы). Наконец, S1P блокирует апоптоз в эндотелиальных клетках, повышая продукцию оксида азота.

Hannun and Obeid недавно высказали предположение, что понимание метаболизма сфинголипидов и тщательная оценка уровня эндогенных биоактивных сфинголипидов в клетке - необходимы, поскольку эти вторичные мессенджеры служат главным переключателем, регулируя многие аспекты клеточных функций и судьбы. Церамид и S1P существуют в клетке как реостат, отвечающий за выживание или гибель клетки. Исследования предполагают возможность регулирования этого реостата извне с терапевтической целью сохранения функции яичников и фертильности.

Семейство Bcl-2

Представители семейства Bcl-2

Митохондрии являются центром клетки, принимающим решение о запуске механизма ее гибели. Мембрана митохондрий разрывается, что приводит к образованию реактивных форм кислорода и высвобождению апоптогенных факторов, служащих сигналом для активации финальной (эффекторной) стадии апоптоза. Точные механизмы, за счет которых повышается проницаемость мембраны митохондрий, до конца не выяснены. Предложено несколько моделей. Большинство из них учитывают действие семейства регуляторных белков Bcl-2, которые самостоятельно или с помощью других белков митохондрий (переносчик аденилового нуклеотида ANT, потенциал-зависимый анионный канал VDAC) нарушают митохондриальный гомеостаз.

Идентифицированы аналоги Bcl-2 млекопитающих у C.elegans (EGL-1, CED-9) и дрозофиллы (Drob-1/Debcl/dBorg-1/Dbok, dBorg-2/Buffy). У позвоночных, включая млекопитающих, эти белки являются ключевыми регуляторами апоптоза. Они состоят из двух антагонистических групп: антиапоптотические белки (Bcl-2, Bcl-x, Bcl-w, Bcl-B, Mcl-1, A1/Bfl-1) и проапоптотические. Последняя группа подразделяется в зависимости от числа Bcl-2-гомологичных (ВН) доменов. Те, что содержат от двух до четырех ВН-доменов - т.н. мультидоменные представители семейства (Bax, Bak, Mtd/Bok, Boo/Diva, Bcl-rambo, Bcl-x-short) - действуют иначе, чем те, что содержат только ВН3-домен (Bad, Bid, Bik/NBK, Bim, Bmf-1, Hrk/DP5, Map-1, Nix, Nip3, Noxa, PUMA).

Раньше считали, что Bcl-2 и подобные белки работают как реостат, и баланс между про- и антиапоптотическими белками определяет судьбу клетки. Однако сегодня известно, что регуляция апоптоза представителями семейства Bcl-2 более сложна, помимо механизма реостата включает в себя стимул-специфическую модификацию ВН3-белками (рис. 19.1 и 19.2). Во многих случаях ВН3-белки служат внутриклеточными сенсорами, которые могут активироваться либо на этапе транскрипции (Nip3, Nix, PUMA, Noxa, Hrk), либо после транскрипции (Bad, Bid, Bik, Blk, Map-1) через множество механизмов сигнальной трансдукции (рис. 19.2). После активации эти белки вступают во взаимодействия со своими мультидоменными собратьями. В зависимости от вида ВН3-белка, эти взаимодействия могут либо облегчить введение проапоптотических мультидоменных белков семейства Bcl-2 через митохондриальную мембрану, нарушая ее целостность и потенциал покоя, необходимый для окислительного фосфорилирования, либо нивелировать действие антиапоптотических белков семейства Bcl-2.

ВН3-белки способны взаимодействовать с мультдоменными представителями семейства Bcl-2 без последующих посттрансляционных изменений.

За исключением гена, кодирующего 2’-5’ олигоаденилат-синтетазу, экспрессия которого индуцируется интерфероном-бета, большинство ВН3-генов экспрессируются в результате повреждения клетки, вызванного гипоксией, повреждением ДНК или отсутствием определенных цитокинов (рис. 19.2). После активации амфифильный альфа-участок многих ВН3-белков взаимодействует с гидрофобной частью антиапоптотических белков семейства Bcl-2, вызывая их реолигомеризацию и отщепление от проапоптотических мультидоменных представителей семейства (рис. 19.1 и 19.2). В этом случае ВН3-белки служат как внутриклеточные лиганды, связывающиеся и блокирующие антиапоптотические Bcl-2-подобные белки, что позволяет проапоптотическим мультидоменным представителям семейства, таким как Bax и Bak, дестабилизировать митохондрии и индуцировать апоптоз.

ВН3-белки

Несмотря на значительную роль этих белков в регулировании принятия решения о жизни и смерти клетки, мы нашли в литературе меньше десятка отчетов об экспрессии или функционировании ВН3-генов в яичниках. Далее мы рассмотрим конкретные примеры.

Bim и Bmf - проапоптотические представители семейства ВН3, модицицируемые после трансляции. В здоровых клетках эти белки подавлены функционированием динеинового двигательного комплекса микротрубочек и актин-миозинового двигательного комплекса. Сигналы, инициирующие высвобождение Bim или Bmf из цитоскелета, различны и включают в себя отмену действия цитокинов, потерю клеточного контакта, химические вещества, разрушающие микротрубочки (таксол), ультрафиолет. Как многие другие ВН3-белки, Bim и Bmf активируются каспаза-независимым путем. Необходимо однако отметить, что помимо посттрансляционной активации, экспрессия bim-гена повышается на уровне транскрипции при уменьшении количества факторов роста в нейронах и гемопоэтических клетках. Более того, bim транскрибируется из одного гена в виде трех различных изоформ (BimEL, BimL, BimS) - в разных типах клеток. Смысл в том, что одна изоформа действует как киллер, а другие либо действуют как менее эффективные киллеры, либо как антагонисты. Соответственно, изменения в экспрессии этих изоформ могут оказывать значительные эффекты на восприимчивость клеток к апоптозу.

Второй пример - Bad, ВН3-белок, облегчает олигомеризацию и инактивацию антиапоптотических Bcl-2-подобных белков. Активность Bad регулируется факторами роста. В их присутствии Bad фосфорилируется с помощью P13-k/Akt сигнального пути и связывается 14-3-3-белками. В отсутствии достаточного количества факторов роста дефосфорилирование Bad приводит к его отсоединению от 14-3-3-белков и проникновению в митохондрию, где он нарушает действие Bcl-2 Bcl-xlong белков (рис. 19.2).

Третий пример: Bid - ВН3-белок, связывающийся с активированным поверхностным рецептором клеточной гибели, таким как Fas (рис. 19.1). Подобно Bim, Bmf и Bad, он активируется после трансляции путем частичного протеолиза, образуя форму tBad, проникающую в митохондрии. В митохондрии tBid взаимодействует с проапоптотическими мультидоменными представителями семейства Bcl-2 (Bax и\или Back) и облегчает их внедрение в мембрану митохондрии. За исключением Мар-1, Bid - единственный ВН3-белок, функция которого осуществляется посредством взаимодействия с проапоптотическими, а не антиапоптотическими мультидоменными представителями семейства Bcl-2 (рис. 19.2).

Последний пример показывает важную роль транскрипционной активации для некоторых ВН3-белков. Ген Р53-модулятора апоптоза (PUMA) кодирует синтез множества вариантов протеинов, который индуцируется во многих типах клеток за счет активации р53, происходящей в ответ на повреждение генома. Подобно большинству других ВН3-белков, изоформы PUMA связывают Вcl-2-подобные белки, локализованные в митохондриях, что индуцирует высвобождение цитохрома с и активирует быструю клеточную гибель. В дополнении к PUMA, подобным действием обладает Noxa. Nix и bNip3 также представляют собой транскрипционно-регулируемые Bcl-2-белки, хотя регулирование транскрипции этих генов напрямую направляется действием гипоксия-индуцируемого фактора 1-альфа в условиях ограниченного кислородного голодания клетки.

ВН3-белки образуют внутриклеточный центр управления, определяющий, подвергнется клетка апоптозу или нет в ответ на потенциальные гибельные стимулы (активация рецепторов гибели, интерферон-бета, гипоксия, повреждение ДНК, недостаток факторов роста). Механизмы активации ВН3-белков разнообразны и включают в себя: транскрипцию, фосфорилирование /дефосфорилирование, протеолиз и изменения цитоскелета. Большинство ВН3-белков служит для инактивации антиапоптотических Bcl-2 - белков, прдупреждая их блокирующее взаимодействие с проапоптотическими мультидоменными представителями семейства, такими как Bax. Только Bid и Map-1 напрямую взаимодействуют с проапоптотическими Bax-подобными белками, облегчая их внедрение в митохондриальную мембрану. В любом случе, влияние ВН3-белков приводит к дестабилизации митохондрий и высвобождению большого числа апоптогенных факторов, активирующих или ускоряющих конечную фазу апоптоза.

Проапоптотические белки, высвобождаемые дестабилизированными митохондриями.

Воздействие проапоптотических белков семейства Bcl-2 на митохондрии приводит к высвобождению межмембранных белов, которые организуют конечную фазу апоптоза. Некоторые из этих белков в норме функционируют внутри митохондрий как посредники окислительно-восстановительных реакций, но при высвобождении в цитозоль, они меняют свою функцию на проапоптотическую. Некоторые высвобождаемые белки, такие как AIF, Omi, Endo-G проявляют нуклеолитическую или протеолитическую активность и вызывают прямое разрушение клетки (рис. 19.1). Например, AIF первоначально был идентифицирован как полипептид, индуцирующий конденсацию хроматина и высокомолекулярную фрагментацию (более 50 kb) ДНК, не зависимую от каспазы. Инактивация гена, кодирующего AIF у мышей показала, что этот белок необходим для первого этапа клеточной гибели, происходящего во время эмбрионального морфогенеза и кавитации. Сериновая эндопротеаза, Omi - это проапоптотический белок, взаимодействующий с Х-связанным белком-ингибитором апоптоза (XIAP) и другими IAP, что обеспечивает полную активацию эффекторного каспазного каскада. Omi также может индуцировать клеточную гибель в присутствии всех каспазных ингибиторов, за счет своего N-концевого домена, обладающего каталитической серинопротеазной активностью. Endo-G, также митохондриального происхождения, после высвобождения перемещается в ядро, где катализирует распад ДНК каспаза-независимым путем. Другие белки, высвобождаемые из митохондрий в процессе апоптоза, служат либо кофакторами, либо компонентами многомерных белковых структур, называющихся апоптосомы.

Постмитохондриальная проверка перед клеточной гибелью

Решение о выборе апоптоза принимается после последней проверки, убеждающей в том, что клетка должна быть уничтожена. Одним возможным механизмом предотвращения клеточной гибели является предотвращение активации каспазного каскада. Антиапоптотические протеины IAP, включающие в себя сюрвивин, ливин, Bruce, нейрональный IАР (NIAP), XIAP, IAP1, IAP2 у млекопитающих, DIAP у Drosophila (до сих пор не найдено аналогов IAP у C.elegans), способны предотвращать каспазный каскад за счет своей способности связывать и инактивировать некоторые каспазы. Каждый IAP содержит как минимум 2 независимых функциональных участка, называемых домены бакуловирусных последовательностей IAP (BIR). Среди известных IAP XIAP уникален в своей способности селективно связываться и инактивировать каспазу-9 за счет своего BIR3-домена; однако он также может связывать и нарушать активность каспазы-3 с помощью связывающего участка между BIR доменами 1 и 2. Значение этого заключается в возможности как минимум временного предотвращения апоптоза на уровне апоптосомы (каспаза-9) или вне ее (каспаза-3).

Однако в клетках, подвергающихся апоптозу, защита IAP может быть преодолена как минимум двумя механизмами. Первый - белок Smac (вторичный митохондриальный активатор каспазы) и DIABLO (прямой IAP-связывающий протеин) - взаимодействует с BIR-доменом IAP в районе его N-конца. Связывая IAP, Smac/DIABLO либо перемещают активированные каспазы, либо предотвращают связывание их с IAP, таким образом активируя каспазозависимый протеолиз и клеточную гибель. Например, было показано, что Smac/DIABLO связываются с XIAP и предотвращают его взаимодействие с каспазой-9, что приводит к быстрому апоптозу под воздействием ультрафиолетового облучения. Второй механизм выведения антиапоптотических протеинов постмитохондриальной проверки - убиквитин-протеосомальный сигнальный путь. Каталитические механизмы, задействованные в этом процессе, активируются самими IAP, поскольку некоторые IAP обладают Е3-убиквитин-лигазной активностью.

Хотя аналоги Smac/DIABLO C.elegans не были клонированы, у Drosophila экспрессируются три таких белка: Reaper, Grim, Hid (рис. 19.1). Структурные и функциональные свойства этих белков похожи на Smac/DIABLO в том, что N-концевой домен каждого способен связывать IAP. Vernooy et al продемонстрировали, что Drosophila Bruce, крупный BIR домен-содержащий белок (BIRP) с Е2-убиквитин-связывающей активностью, потенциально способен подавлять Reaper- и Grim-зависимую, но не Hid-зависимую клеточную гибель (рис. 19.1). У млекопитающих и C.elegans тоже экспрессируются BIRP, и так же как у дрозофиллы, каждый из них обладает уникальной функцией, не связанной с апоптозом. Исследования на мутантных мышах, не имеющих IAP-1, IAP-2 или XIAP не выявили значительной необходимости в IAP для выживания клеток in vivo. Однако это может быть объяснено перекрестом действий других представителей семейства IAP. Например, Harlin et al определили, что клетки, взятые у XIAP-дефицитных мышей экспрессируют высокие уровни IAP-1 и IAP-2, что позволяет предположить компенсаторную экспрессию других представителей семейства IAP при потере экспрессии XIAP.

В отличие от делеции других IAP-генов, удаление сюрвивина приводит к смертности эмбрионов на 4-5 день развития. Это происходит из-за нарушения формирования микротрубочек, что приводит к полиплоидии и нарушениям клеточного деления. Сюрвивин млекопитающих, как многие другие белки-регуляторы апоптоза, проявляет двойную функцию. В то время как потеря его IAP-подобной функции компенсируется другими IAP, функциональный домен сюрвивина, контролирующий образование микротрубочек и клеточное деление, необходим для выживания клетки и не может быть компенсирован другими белками.

Апоптосома

Точная роль высвобождения цитохрома с из митохондрии стала известна, когда аналог CED-4 позвоночных, Apaf-1 (апоптотический протеаза-активирующий фактор-1) был клонирован и функционально охарактеризован как часть тримерного белкового комплекса, состоящего из Apaf-1, Apaf-2 (цитохром с) и Apaf-3 (прокаспаза-9) (рис. 19.1). Сегодня установлено, что индукция высвобождения цитохрома с из митохондрий проапоптотическими белками семейства Bcl-2 вызывает конформационные изменения Apaf-1, формируя каспазный домен (CARD). CARD Apaf1 затем взаимодействует с CARD неактивированного каспаза-9-зимогена. Результатом этого взаимодействия является формирование олигомеров прокаспазы-9, которые в свою очередь путем ауто- и транскатализа образуют протеолитический комплекс, называемый апоптосомой (рис. 19.1). После процессинга и полной активации каспаза-9 служит конечным ферментом протеолитического каскада, включающего в себя активацию множества эффекторных каспаз, осуществляющих апоптоз. С этой точки зрения, значение Apaf-1 у позвоночных, так же как CED-4 у C.elegans и Dark/Dapaf-1 у Drosophila, заключается в связывании функционирования белков семейства Bcl-2 с активацией каспаз. Каспазы расщепляют ключевые белки клетки, необходимые для поддержания ее функций и гомеостаза. Фундаментальное значение апоптосомы в процессе клеточной гибели у позвоночных становится видным у мышей, лишенных генов каспазы-9 или Apaf-1, у которых большинство гомозиготных эмбрионов умирают в процессе гестации из-за остутствия апоптоза во время критических периодов эмбриогенеза.

Эффекторная фаза апоптоза и разрушение клеточных белков: каспазы

У млекопитающих идентифицировано как минимум 14 CED-3 аналогов, большинство из которых участвуетв процессе апоптоза. Эти аналоги, называемые каспазы 1-14 (цистеин-аспартат-специфичные протеазы), транслируются в неактивных формах, которые далее активируются путем частичного протеолиза. Механизмы активации каспаз подразделяют эти ферменты на 2 различные категории. Первая, включающая каспазы-2, -8, -9, -10, - инициаторные каспазы. Эти ферменты обладают уникальными структурными доменами, облегчающими аутокатализ, процесс, необходимый для объединения белков в единый комплекс. Например, каспазы-8 и -10, каждая, содержат N-концевой эффекторный домен, позволяющий этим каспазам взаимодействовать с рецепторами клеточной гибели (Fas, TNFRI) с помощью адаптерного белка FADD. Инициаторные каспазы-2 и -9, каждая, содержат CARD. Каспаза-9 взаимодействует с Apaf-1 в процессе апоптоза, что опосредуется высвобождением цитохрома с из митохондрий. Эти взаимодействия происходят за счет присутствия CARD как в каспазе-9, так и в Apaf-1. Активация каспазы-12, другой инициаторной каспазы, как недавно было показано, происходит путем, не зависимым от митохондрии и Apaf-1, в ответ на повреждение на уровне эндоплазматического ретикулума. После процессинга активные инициаторные каспазы активируют вторую линию ферментов своего семейства - инициаторные каспазы (каспаза-3, -6 и -7). Активные эффекторные каспазы селективно гидролизуют широкий спектр полипептидных целей, включая протеин-киназы, белки сигнальной трансдукции, компоненты цитоскелета, ингибиторы дезоксирибонуклеаз. Т.о., активация каскада эффекторных каспаз не только делает клетку неспособной выполнять свои функции и поддерживать гомеостаз, но и облегчает разрушение и упаковку клеточных структур в небольшие тельца, ограниченные мембраной, готовые к фагоцитозу - конечному этапу апоптоза. Zheng et al использовали модель клеточных рецепторов гибели in vivo, чтобы продемонстрировать, что удаление одной из каспаз (-9 или -3) путем удаления ее гена откладывает гибель гепатоцитов. Иммуноблот-анализ различных представителей семейства каспаз выявил, что каспазы-2, -6 и -7 активировались в экстрактрах. Приготовленных из клеток, не имеющих каспаз -9 или -3. Из этого исследования был сделан вывод о том, что митохондриальный путь активации каспаз (формирование апоптосомы и активация каспазы-9) может вовлекать в себя одновременную активацию различных альтернативных инициаторных и эффекторных каспаз, вплоть до количества, достаточного для эффективного уничтожения и удаления клеточных структур путем апоптоза.

АПОПТОЗ В СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ ЯИЧНИКОВ

Гибель клеток гранулезы во время атрезии фолликулов

Соматические клетки яичниковых фолликулов - хорошая модель для исследования влияния гормонов, факторов роста и цитокинов на судьбу клеток. Клетками, больше всего подвержеными апоптозу, связанному с атрезией зрелого фолликула, являются клетки гранулезы. Однако у некоторых видов апоптозу подвергаются клетки теки (свиньи, куры, крысы), апоптоз в клетках теки происходит значительно позже, чем в гранулезе. Вероятно клетки теки осузествляют антиапоптотическое действие на клетки гранулезы. В потверждение этой гипотезы клетки бычьей гранулезы дольше не подвергались апоптозу, индуцированному дефицитом питательных веществ, при совместном культивировании с тека-клетками.

Множественные исследования in vitro и in vivo показали, что апоптоз в клетках гранулезы может быть ингибирован различными факторами роста, прогестероном, эстрогенами и гонадотропинами. И наоборот, проапоптотическим действием обладают различные цитокины, андрогены и ГнРГ.

Рецепторы клеточной гибели и атрезия

Давно известно, что цитокины играют значительную роль в процессах развития, функционирования и отмирания соматических клеток фолликулов. Самые значимые цитокины, включающие TNF-альфа и Fas-лиганд (FasL), отвечающие за апоптоз, описаны детально. В яичниках у некоторых видов биоактивный TNF-альфа присутствует в фолликулярной жидкости, а также в изолированной культуре клеток гранулезы in vitro. Кроме того, обработка клеток гранулезы TNF-альфа снижает уровень стероидного регуляторного белка (StAR) и индуцирует апоптоз. Нарушения стероидогенеза отмечаются раньше, чем активация апоптоза, что позволяет предположить существование независимых механизмов TNF-альфа-регуляции стероидогенеза и апоптоза. Однако хорошо известно, что митохондрии играют критическую роль в инициации и завершении апоптоза. Т.о. способность TNF-aльфа влиять на уровни ключевых митохондриальных белков в клетках стероидогенеза может быть одним из ранних процессов дестабилизации митохондрий.

FasL - другой известный представитель семейства TNF, присутствующий в яичниках. FasL и его рецептор экспрессируется фолликулярными клетками мышей, крыс, коров, свиней, кур и людей. У женщин клетки гранулезы антральных фолликулов экспрессируют Fas в ранние стадии атрезии, при этом уровень Fas повышается параллельно прогрессированию атрезии. Для сравнения, Fas не обнаруживается в клетках теки вплоть до поздних стадий атрезии. Обработка культуры клеток гранулезы FasL или Fas-активированными антителами может индуцировать апоптоз in vitro, а введение самкам мышей in vivo Fas-активированных антител увеличивает уровень апоптоза гранулезных клеток и атрезии фолликулов. Значение системы Fas/FasL подтверждается резульатами опытов на мутантных мышах. Например, у lpr/lpr мышей наблюдается снижение или полное отсутствие экспрессии Fas (в зависимости от изучаемой ткани), а у мышей gld/gld отсутствует функционирующий FasL. У самок этих мутантных линий наблюдается нерегулярный менструальный цикл, повышена частота встречаемости кист яичников, а у самок lpr/lpr повышено число вторичных фолликулов.

Имеется несколько отчетов о возможной роли других клеточных рецепторов помимо TNFRI и Fas. Экспрессия TRAIL-decoy-рецептора-1 (DcR1) показана в свиных клетках гранулезы, уровень DcR1 были ниже в атрезирующихся фолликулах по сравнению с здоровыми. Удаление DcR1 из клеток гранулезы за счет отщепления их гликофосфолипидного участка, прикрепляющего их к мембране, а затем обработка TRAIL - индуцировало апоптоз, что позволяет предположить антиапоптотическую роль DcR1 во время развития фолликула. В яичниках домашних кур экспрессия птичьего аналога DR6 зафиксирована в клетках гранулезы, повышенный уровень мРНК DR6 и самого белка коррелировал с фолликулярной атрезией. Птичий TVB, еще один представитель семейства рецепторов гибели, аналогичный DR5 млекопитающих, также экспрессируется в клетках гранулезы у кур, однако его роль в процессе апоптоза гранулезных клеток, если и есть, пока неизвестна.

Сигнальная трансдукция при апоптозе в клетках гранулезы

При использовании в качестве модели неполовозрелых крыс, лишенных гонадотропинов, было показано, что активность JNK повышается в процессе апоптоза в клетках гранулезы, однако это повышение активности отмечалось уже после биохимических признаков апоптоза, что позволяет предположить, что JNK может облегчать или усиливать процесс клеточной гибели, но не инициировать его. С другой стороны, нарушение ERK-сигнального пути определялось задолго до каких-либо признаков апоптоза в клетках гранулезы, что показывает, что снижение активности антиапоптотических сигнальных механизмов может быть важным инициироующим фактором апоптоза в клетках гранулезы. Эта гипотеза поддерживается изучениями роли PI3-K/Akt в выживании клеток гранулезы. Этот сигнальный антиапоптотический путь активируется множеством факторов роста, включая ИПФР-1, ЭФР и основной фактор роста фибробластов, которые все предотвращают апоптоз в культуре клеток гранулезы in vitro и в гранулезных клетках интактного фолликула, инкубировнного in vitro.

Было показано, что обработка гранулезных клеток ИПФР-1 стимулирует активность PI3-K Akt за счет ИПРФ-1 - опосредованного фосфорилирования и активации Akt, зависимых от времени воздействия и концентрации. Более того, усиление фосфорилирования и активация Akt, и последующее блокирование апоптоза в клетках гранулезы, происходящее при воздействии ИПФР-1, может быть уменьшено ингибиторами PI3-K - LY294002 или вортманнином. Похожие результаты получены при изучении клеток гранулезы птиц, культивированных in vitro, на которых было показано, что ИПФР-1 и TGF-альфа индуцируют быстрое фосфорилирование Akt, которое можно предотвратить совместной обработкой LY294006. Способность LY294006 противостоять действию ИПФР-1 не подавляется фосфорилированием Akt, ингибиторы PI3-К также блокируют антиапоптотическое действие факторов роста в клетках гранулезы. Апоптоз, вызванный блокированием PI3-K, предотвращается обработкой клеток либо ЛГ, либо аналогами цАМФ, что позволяет предположить, что протеинкиназа А может полностью компенсировать антиапоптотическое действие PI3-K в случае его отсутствия. Фосфорилирование ERK тоже индуцируется ИПФР-1 и TGF-альфа в клетках гранулезы птиц, однако обработка ингибиторами MAPK-киназы (U0126, PD98059), хотя и способно полностью блокировать ERK, не приводит к развитию апоптоза.

Сигнальный путь сфингомиелина или как минимум церамида, также изучался в контексте гибели клеток гранулезы у различных видов. Первый отчет продемонстрировал, что короткоцепочечные аналоги церамида способны проходить через плазматическую мембрану, а стимулы, вызывающие эндогенную продукцию церамидов (например химиотерапия или ультрафиолет) вызывают быструю индукцию апоптоза в культурах клеток птичьей гранулезы in vitro. Более того, предварительная обработка клеток ингибитором церамид-синтазы, фумонизином-В1 (FB1), может предотвратить развитие апоптоза, инициированного цитотоксическим препаратом даунорубицином. Однако FB1 не оказывает защитного эффекта на клетки птичьей гранулезы, обработанные ультрафиолетом, что позволяет предположить, что различные внешние факторы стимулируют продукцию церамидов в клетках гранулезы различными механизмами, каждый из которых приводит к апоптозу. Это предположение соответствует более ранним данным, определившим необходимость именно кислой сфингомиелиназы (ASMазы), а не церамид-синтазы, для образования церамида во время апоптоза, индуцируемого радиацией, в легочном эпителии и при индуцируемой ультрафиолетом активации JNK. Исследования с крысиными фолликулами, культивированными in vitro, показали, что короткоцепочечные аналоги церамида препятствуют выживанию фолликулярных клеток, которому способствуют гонадотропины.

Представители семейства Bcl-2 - детерминатны судьбы клеток гранулезы

По современным данным семейство Bcl-2 включает в себя антиапоптотические (Bcl-2, Bcl-xlong, Mcl-1), проапоптотические мультидоменные (Bax, Bak, Mtd/Bok, Boo/Diva) и ВН3-белки (Bad, Bim/Bod). Первые исследования показали, что гонадотропин-опосредованное блокирование апоптоза в клетках гранулезы крыс приводит к повышению соотношения экспрессии bax/bcl-2, bcl-xlong, а так же к повышению уровней соответствующих белков. Инактивация гена bax у мышей приводила к накоплению аномальных фолликулов в яичниках, содержащих атрофированные клетки гранулезы, которые не смогли подвергнуться апоптозу в процессе атрезии фолликулов. Эти данные вместе с находками повышенного уровня белка Bax в атретических фолликулах у людей, указывают на то, что Вах вероятно функционирует как ключевой модулятор судьбы клеток гранулезы у различных видов.

Дополнительные исследования яичников птиц показали, что экспрессия Bcl-2 и Bcl-xlong значительно выше в клетках гранулезы доминантных фолликулов, отобранных для овуляции по сравнению с клетками гранулезы антральных фолликулов, которые сохраняют способность подвергнуться атрезии. Кроме того, экспрессия NR-13, антиапоптотического Bcl-2 - подобного белка у птиц, наблюдается только в преовуляторных фолликулах. Повышенная экспрессия некоторых антиапоптотических представителей семейства Bcl-2 в преовуляторных фолликулах коррелирует с повышенной устойчивостью соответствующих клеток гранулезы к атрезии in vitro и с отсутствием признаков атрезии фолликулов на соответствующих стадиях развития фолликулов in vivo. Mcl-1 - еще один антиапоптотический представитель семейства Bcl-2, которые функционирует как регулятор выживания клеток гранулезы. Nothern blot анализ показал, что mcl-1 экспрессируется в яичниках крыс, и эта экспрессия усиливается под влиянием сывороточных гонадотропинов беременных морских свинок (PMSG). Более того, in situ гибридизация продемонстрировала, что мРНК, кодирующая Mcl-1, явно присутствует в клетках гранулезы и теки растущих фолликулов.

Кроме Вах, экспрессия Mtd/Bok, мультидоменного представителя семейства Bcl-2, зафиксирована в яичниках крыс. Гибридизация in situ доказала присутствие Mtd/Bok в клетках гранулезы антральных фолликулов и минимальную экспрессию гена в тека-интерстициальных клетках. Было также показано, что уровень мРНК, кодирующей Bok, повышен в клетках гранулезы крыс, подвергнувшихся апоптозу in vitro. Diva/Boo, представитель семейства Bcl-2, чья роль в апоптозе остается противоречивой, также значительно повышен в клетках гранулезы яичников и коррелирует со степенью атрезии. Однако инактивация гена Diva/Boo у мышей не вызывает видимых аномалий яичников или нарушений плодовитости, оставляя неотвеченным вопрос о важности этого белка для реализации программы клеточной гибели клеток гранулезы. Представитель семейства ВН-3, Bad, экспрессируется в клетках гранулезы и текса-интерстициальных клетках яичников крыс, и хотя уровни его иРНК в клетках гранулезы остаются неизмененными после обработки апоптотическими стимулами, повышенная экспрессия Bad в клетках гранулезы крыс индуцирует апоптоз. Более того, редукция фосфорилированной (неактивной) формы Bad коррелирует с инициацией апоптоза в клетках гранулезы крыс в процессе атрезии фолликулов in vivo. Наконец, представитель семейства ВН-3, Bim (переименованный у крыс в Bod по неизвестным причинам) экспрессируется в яичниках крыс и людей, хотя типы клеток, экспрессирующих этот ген, и его роль в апоптозе, если таковая существует, остаются неизвестными.

Апоптосома и каспазы в процессе гибели клеток гранулезы

Как обсуждалось ранее, образование апоптосомы требует высвобождения цитохрома с из дестабилизированной митохондрии - событие, инициируемое действием представителей проапоптотического семейства Bcl-2 - и присутствия Apaf-1 и каспазы-9. В мышиных клетках гранулезы, подвергшихся апоптозу путем лишения сыворотки in vitro, первым шагом образования апоптосомы является высвобождение цитохрома с. В похожем исследовании экспрессия Apaf-1 на уровнях мРНК и белковом зафиксирована в яичниках мышей, с корреляцией повышенного уровня Apaf-1 в клетках гранулезы и наступлением атрезии фоликулов in vivo. Хотя прямые взаимодействия между цитохромом с и Apaf-1 в клетках гранулезы еще не изучены, факт такого взаимодействия - процессинг и активация каспазы-9 и эффекторных каспаз, таких как каспаза-3, был зафиксирован. Предварительные исследования показали, что инактивация гена каспазы-9 у мышей приводит к нарушениям апоптоза клеток гранулезы и нарушениям фолликулярной атрезии in vivo, что указывает на то, что апоптосома действительно образуется и функционирует в клетках гранулезы в процессе апоптоза.

Важнейшую роль в процессе атрезии фолликулов играют эффекторные каспазы. Многие из них, идентифицированные у позвоночных к настоящему времени, экспрессируются в яичниках, недавние исследования показали важную роль по крайней мере каспазы-3 и, возможно, каспаз-6 и -7 в осуществлении апоптоза клеток гранулезы. Была показана обратная зависимость между экспрессией каспазы-3 (мРНК и белка) и апоптозом в клетках гранулезы грызунов и человека. В клетках гранулезы мыши во время апоптоза определяется процессинг прокаспазы-3 и каспаза-3 - подобная ферментативная активность, а селективный пептидный ингибитор каспазы-3, проникающий через клеточную мембрану, подавляет процесс гибели клеток в культуре овариальной ткани мышей. Центральная роль каспазы-3 в реализации апоптоза клеток гранулезы доказана в опытах на мутантных мышах, не имеющих каспазы-3, у самок которых обнаружено множество аномальных атретических фолликулов, содержащих клетки гранулезы, не подвергшиеся апоптозу. Эти in vivo находки подтверждаются множеством данных in vitro - с использованием изолированных клеток гранулезы и интактных фолликулов в культурах, свободных от сыворотки, - демонстрирующих отсутствие ключевых биохимических маркеров апоптоза в мутантных клетках гранулезы по сравнению с обычными, культивированными параллельно. Однако клетки гранулезы, лишенные каспазы-3, все-таки способны подвергнуться апоптозу, возможно за счет компенсаторной индукции каспазы-7. Последние исследования на птичьих тканях предположили возможную подобную функцию каспазы-6.

Апоптоз и регрессия желтого тела

На эту тему существует множество исследований. Апоптоз обнаружен во время инволюции желтого тела у мышей, крыс, кроликов, овец, коров, свиней и приматов. Однако остаются некоторых проблемы. Во-первых, связан апоптоз с прекращением стероидогенеза, ассоциированным с регрессией желтого тела, или нет - остается до конца не выясненным, и, похоже, зависит от различных факторов. Многие исследования регрессии желтого тела основаны на введении экзогенных лютеолитических препаратов, которые могут нарушать естественные процессы, происходящие в нормальном меструальном цикле. Использование желтого тела, полученного от беременных животных, создает дополнительные сложности, поскольку желтое тело беременности отличается от желтого тела обычного менструального цикла.

Несмотря на описанные сложности, проведено большое число исследований на различных in vivo моделях по изучению роли апоптоза в регрессии желтого тела. Из-за особенностей клеточного состава, in vitro модели дают результаты, которые трудно интерпретировать и экстраполировать на живой организм. Например, простагландин F2альфа - лютеолитический агент - не является цитотоксическим относительно клеток желтого тела in vitro. Питательная среда культуры клеток желтого тела содержит повышенный уровень прогестерона, несмотря на активацию апоптоза.

Цитокины, рецепторы клеточной гибели, сигнальная трансдукция при апоптозе клеток желтого тела

Представители семейства рецепторов клеточной гибели и их лиганды принимают участие в механизмах регрессии желтого тела, включая прекращение стероидогенеза и инволюцию самой структуры. Например, временная и пространственная экспрессия Fas и его лиганда в человеческом, мышином и коровьем желтом теле ассоциирована с его регрессией. Аналогично с процессом в клетках гранулезы, Fas-активирующие антитела или FasL индуцируют апоптоз в культуре клеток желтого тела. Внутривенное или внутриперитонеальное ввеление Fas-активирующих антител вызывает лютеолиз у мышей. Активация Fas в клетках желтого тела повышает активность множества представителей семейства МАРК, однако значение этих сигнальных путей в регуляции функции желтого тела не до конца ясно. Fas-опосредованная клеточная гибель приводит к активации каспазы-3; изучение мутантных мышей, лишенных этого апоптотического фактора, поддерживают тезис о его центральной роли в лютеолизе. Функциональное значение системы Fas/FasL в лютеолизе также доказано в исследованиях на мутантных мышах, не имеющих Fas (lpr/lpr) или FasL (gld/gld), у которых наблюдался нерегулярный эстральный цикл с нарушениями развития фолликула и регресса желтого тела.

TNF-альфа тоже участвует в регуляции регрессии желтого тела. Хотя обычное место его синтеза - моноциты и макрофаги, значительное количество TNF-альфа обнаружено в эндотелиальных клетках - компонентах желтого тела. Экспрессия TNF-альфа была продемонстрирована в желтом теле кроликов, крыс, свиней, коров и людей. Хотя уровни мРНК, кодирующей TNF-альфа, не менялись в желтом теле в течение цикла, уровень cамого белка был ниже в раннюю лютеиновую фазу, значительно повышался в позднюю и падал после регрессии. Так же в анализе Nothern blot м РНК TNF-альфа не определялась, а его биологическая активность повышалась после падения уровня прогестерона во время регрессии желтого тела. Большинство исследований, изучавших подтипы рецепторов TNF-альфа в желтом теле, были сфокусированы на роли TNFRI. TNF-альфа - связывающие участки в желтом теле были идентифицированы у многих видов. У TNF-альфа обнаружены как лютеотропные, так и лютеолитические свойства. Разница была видо- и время-специфической. In vitro TNF-альфа является цитотоксическим по отношению к культуре эндотелиальных клеток, полученных из желтого тела коров, и он может усиливать клеточную гибель, индуцированную интерфероном-гамма, в стероидогенных клетках желтого тела тех же коров. TNF-альфа активирует стресс-зависимый сигнальный путь, а также сфингомиелиновый путь. Roby et al продемонстрировали, что у мутантных мышей, лишенных TNFRI, цикл останавливался в лютеиновой фазе. Похожие результаты были получены Bukovsky et al, которые отметили, что введение крысам антисыворотки к тимусу, блокируя иммунную функцию, останавливает цикл в лютеиновой фазе. Хотя это исследование не потверждает конкретной роли TNF-альфа, оно потверждает роль иммунной системы в регуляции функции желтого тела.

Представители семейства Bcl-2 как регуляторы апоптоза клеток желтого тела

Rodger et al первыми определили экспрессию Bcl-2 и Bax в человеческом желтом теле. Bcl-2 экспрессируется в гранулеза-лютеиновых, текса-лютеиновых и эндотелиальных клетках некоторых кровеносных сосудов. Однако не было обнаружено изменений уровня Bcl-2 или Bax в течение лютеиновой фазы. Более поздние исследования показали, что экспрессия Bcl-2 в желтом теле у человека может регулироваться в течение менструального цикла, при ранней беременности - под действием ХГЧ. Недавние же работы показали, что уровень Bax в желтом теле низок в середине лютеиновой фазы, повышается во время регрессии желтого тела и отсутствует в желтом теле беременности.

Роль апоптосомы и каспаз в регрессии желтого тела

Изменения соотношения Вах и Bcl-2 не так важны, как изменения их внутриклеточной локализации. Например, Вах переходит в митохондрию после получения клеткой информации, индуцирующей апоптоз. Митохондрии - основной участник механизма развития апоптоза, однако в стероидогенных клетках эти органеллы также очень важны для синтеза стероидных гормонов. ультраструктурные изменения в митохондриях во время лютеолиза были описаны в 1966г. Было отмечено, что перед снижением продукции прогестерона в клетках желтого тела овец митохондрии набухают, и в них происходит разрушение матрикса. Эти изменения очень похожи на те, что происходят в митохондриях клеток, подвергающихся апоптозу. Однако, пока не установлено, приводят ли эти изменения в митохондриях к образованию апоптосом.

Имеются наблюдения, поддерживающие ключевую роль каспаз в регрессии желтого тела. Например, каспаза-3, вероятно лучше всего изученный фермент, присутствует в клетках желтого тела крыс и людей и активируется в ответ на индуцируемую простагландином F2альфа регрессию желтого тела. У мутантных мышей, лишенных каспазы-3, апоптоз в клетках желтого тела наступает значительно позже, чем у нормальных мышей.

Апоптоз женских половых клеток

Постнатальный апоптоз ооцитов - основной процесс, лежащий в основе атрезии незрелых фолликулов и истощения яичников с возрастом. Механизм и регуляция апоптоза в женских половых клетках подразделяются на 2 основные категории: процесс, происходящий при естественном развитии яичников, и процесс, происходящий в ответ на патофизиологическое повреждение.

ПОТЕРЯ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ВО ВРЕМЯ ВНУТРИУТРОБНОГО РАЗВИТИЯ ЯИЧНИКОВ

Гормоны и пути сигнальной трансдукции в половых клетках яичников

Был достигнут значительный прогресс в изучении механизмов делеции ооцитов, в основном за счет опытов на генетически мутантных мышах, лишенных ключевых регуляторов апоптоза, и за счет использования культур эмбриональных клеток яичников. Например, мышиные фетальные яичники, удаленные на 13,5 день гестации (время инициации мейоза непосредственно перед наступлением апоптоза половых клеток) и культивированные in vitro без добавления ростовых факторов, подвергались время-зависимому апоптозу, через 72 часа оставалось только 10% исходного пула половых клеток. Согласно результатам, полученным при изучении изолированных примордиальных половых клеток в культуре, добавление фактора стволовых клеток (SCF), фактора ингибирующего лейкемию (LIF) и ИПФР-1 в среду предотвращало потерю половых клеток за счет механизма, вовлекающего PI3-K сигнальный путь.

Исследования показали, что гибель стволовых клеток в помещенных в среду фетальных яичниках мышей, лишенных тропического фактора, требует присутствия церамид-генерирующего фермента (ASMазы), что позволяет предположить, что клеточный стресс, вызываемый отсутствием сыворотки, не только выключает фактор-зависимый PI3-K сигнальный путь, но также запускает продукцию церамида как медиатора апоптоза. Это заключение было поддержано параллельными находками, что в мышиных фетальных яичниках, лишенных сыворотки, культивируемых in vitro, может быть достигнут уровень выживаемости половых клеток, сходный с таковым в фетальных яичниках здоровых мышей - либо за счет дефицита ASMазы, либо за счет добавления антагониста церамида S1P. Эти in vitro находки подтверждены исследованиями in vivo о том, что ASM-аза - дефицитные мыши-самки обладают значительно большим резервом примордиальных фолликулов сразу после рождения по сравнению со здоровыми мышами своего вида. В целом подтверждается центральная роль ASM-аза - генерированного церамида в уничтожении половы клеток в фетальных яичниках. Находка того, что PI3-K и церамид играют потенциально противоположные роли в регуляции судьбы развивающихся женских половых клеток поддерживается результатами, полученными на соматических клеточных линиях, которые показывают, что церамид напрямую подавляет активность PI3-K и Akt, в то время как повышенная экспрессия Akt может блокировать образование церамида и защищать клетки от церамид-индуцированного апоптоза.

Роль представителей семейства Bcl-2 в определении судьбы ооцитов

Кроме PI3-K и церамида, некоторые представители семейства Bcl-2 вовлечены в регуляцию апоптоза (подавление - Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w - и активацию - Вах) половых клеток фетальных яичников. Иммуноцитохимические исследования мышиных фетальных ооцитов показали накопление Вах-протеина в разрушающихся половых клетках, в то время как в здоровых клетках уровень белка был низок. Уровень Bcl-2 в фетальных ооцитах был крайне низок и оставался неизмененным независимо от состояния «здоровья» ооцитов, в то же время исследования на мышах, лишенных Bcl-2, показали, что у мутантных самок имеется очень маленький пул примордиальных фолликулов в молодом возрасте. Однако влияние дефицита Bcl-2 на количество постанатальных ооцитов не критично, видимо большее значение в развитии женских половых клеток имеют другие антиапоптотические представители семейства Bcl-2. Исследование на мышах со сниженной экспрессией Bcl-x в половых клетках показало, что мутантные самки рождались со значительно сниженным резервом примордиальных фолликулов за счет избыточного апоптоза половых клеток во время фетального развития. Одновременная инактивация гена bax восстанавливала уровень половых клеток до нормального у bcl-x мутантных мышей, что подтверждает концепцию о том, что баланс Bcl-xL/Bax является определяющим для решения судьбы ооцитов.

События в митохондриях и каспазы при апоптозе женских половых клеток

Исследования показали, что Apaf-1 экспрессируется в женских половых клетках, и что митохондрии играют критическую роль в регуляции активации апоптоза в ооцитах. Предварительные исследования каспаза-9 - дефицитных мышей выявили, что у этих особей апоптоз в развивающихся половых клетках действительно нарушен. Исследования мутантных мышей, лишенных каспазы-2, показали, что эта каспаза необходима для активации апоптоза в половых клетках фетальных яичников, вызванного недостаточностью цитокинов. Потеря женских половых клеток из-за нарушений мейоза связана с инактивацией гена мутации атаксия-телеангиоэктазия (Atm) и не зависит от присутствии каспазы-2, что позволяет предположить множественные стимуло-специфичные пути регуляции развития ооцитов во внутриутробном периоде.

Генетические предпосылки выживания половых клеток

При изучении различий между числом примордиальных и всех незрелых (примордиальных, первичных, преантральных) фолликулов у одной аутбредной и 5 инбредных линий мышей от новорожденности до взрослого возраста, Canning et al выявили двухкратное различие в размерах резерва примордиальных фолликулов между генотипами, а также завивисимые от генетической принадлежности различия в уровне атрезии незрелых фолликулов. Хотя идентификация гена (генов), отвечающих за реализацию этих эффектов в яичниках, пока не осуществлена, проведенные исследования позволяют предположить, что ген (гены) связаны либо напрямую, либо опосредованно, с регулированием апоптоза половых клеток. Кроме того, гены влияют на регуляцию других аспектов женской репродуктивной функции у самок, включая чувствительность половых клеток к цитотоксическим эффектам внешних химических веществ, а также уровень овуляции, индуцированный гонадотропинами.

Потеря половых клеток в результате патофизиологических повреждений

Женские половые клетки очень чувствительны к широкому спектру химических и радиационных агентов, многие исследователи занимаются изучением роли апоптоза при гибели ооцитов от внешних повреждающих влияний.

Полициклические ароматические углеводороды и гибель ооцитов

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) включают в себя включающие бензпирен, 9,10-диметилбензантрацен (ДМБА) и 3-метилхолантрен. Эти химикаты образуются после обработки органических веществ, чаще всего после сжигания топлива и табака. Вулканы и лесные пожары также производят ПАУ, очень большое их количество образуется вокруг дорог, а также на производстве, в частности, алюминия. Таким образом, производимые человеком умышленно (табакокурение) или неумышленно (производство), ПАУ представляют собой серьезную угрозу его здоровью. Уже более 20 лет назад было установлено, что ПАУ потенциально токсичны относительно половых клеток, вызывают быстрое разрушение пула незрелых фолликулов при экспериментах in vivo.

Быстрая потеря половых клеток путем апоптоза происходит у плодов женского пола у беременных мышей, которым вводили бензпирен либо ДМБА во время гестации. У людей отмечена связь между курением во время беременности и снижением резерва ооцитов у плода женского пола. Эти данные вместе с информацией о более раннем наступлении менопаузы у курящих женщин показывают, что химические вещества, присутствующие в сигаретном дыму, нарушают овогенез у плода и разрушают существующие половые клетки в яичниках после рождения. Хотя табачный дым содержит много токсичных веществ помимо ПАУ, данные, полученные на животных, четко указывают именно на ПАУ, как ответственых за эти изменения.

ПАУ могут играть роль искусственных лигандов для рецептора ароматических углеводородов (AHR), являющегося фактором транскрипции. Этот рецептор является представителем семейства регуляторов транскрипции Per-Arnt-Sim (PAS), которые модулируют широкий спектр физиологических функций организма. Хотя естественные лиганды этого рецептора пока не идентифицированы, эксперименты с мутантными особями показали, что потеря функции AHR при отсутствии токсических воздействий вызывает множество фенотипических аномалий, включая значительное увеличение резерва примордиальных фолликулов при рождении за счет дефектного апоптоза в половых клетках фетальных яичников. В опытах на мышах с дефицитом AHR было продемонстрировано, что этот фактор транскрипции необходим ПАУ для разрушения незрелых фолликулов в яичниках мышей после рождения. Компьютерный анализ генов выявил, что bax ген является мишенью для транскрипционной регуляции ПАУ-активированного AHR в ооцитах мышей. Инактивация гена bax полностью защищает женские половые клетки от цитотоксического влияния ПАУ in vitro и in vivo. ПАУ индуцируют аккумуляцию Bax с последующим апоптозом ооцитов в человеческих примордиальных и первичных фолликулах in vivo (на ксенографтных мышино-человеческих моделях), что представляет собой эволюционно новый сигнальный путь клеточной гибели, отвечающий за опосредование патофизиологического влияния ПАУ на гибель женских половых клеток.

Гибель фолликулов, вызванная 4-винилциклогексен диепоксидом

В отличие от ПАУ, который образуется в результате естественных и антропогенных процессов, 4-винилциклогексен (ВЦГ) и его метаболит 4-винилциклогексен диепоксид (ВЦД) образуются в основном как побочные продукты производства пластмасс, резины и пестицидов. Хотя не существует данных о влиянии ВЦГ и ВЦД на людей, эксперименты на животных моделях показали, что обработка ВЦД in vivo разрушает пул незрелых фолликулов с вовлечением апоптоза. Исследования показали, что незрелые фолликулы в яичниках крыс, обработанных ВЦД, имеют повышенный уровень мРНК bax, а также перераспределение Вах-белка из цитозоля в митохондриальный компартмент. Исследования на мутантных моделях подтвердили функциональную необходимость Вах для ВЦД-индуцированной гибели примордиальных и первичных фолликулов у мышей, хотя обнаружен и Вах-независимый компонент повреждающего яичники действия ВЦД.

Обнаружено участие инициаторных (-8 и -9) и эффекторных (-3) каспаз в ВДЦ-индуцированной гибели фолликулов, хотя время активации каспазы-9 и наступления апоптоза после повторного воздействия ВЦД вызывает вопрос о роли каспазы-9 в гибели фолликулов под влиянием этого токсического фактора. И наоборот, повышенная активность каспаз - 8 и -3 имеют временную связь с наступлением ВЦД-индуцированной дегенерации фолликулов, что позволяет предположить, что эти два фермента могут быть основными инициаторными\эффекторными каспазами в этой модели. Как и в примере с Вах, эксперименты на мутантных особях поддерживают гипотезу о роли каспазы-3 в потере первичных фолликулов после обработки ВЦД, однако отсутствие каспазы-3 не оказывает защитного эффекта на примордиальные фолликулы, что предполагает возможность участия других представителей семейства каспаз в реализации апоптоза фолликулов, индуцированного ВЦД. У мутантных мышей, лишенных каспазы-2, как и у лишенных каспазы-3, степень деструкции первичных фолликулов после воздействия ВЦД была ниже, чем у здоровых мышей, однако потеря примордиальных фолликулов под воздействием ВЦД не зависела от гентотипа. Это может объясняться тремя теоретическими возможностями. Во-первых, разрушение фолликулов, вызванное воздействием ВЦД, требует действия различных эффекторных каспаз, таким образом отсутствие одного фермента может минимально сказаться или вообще не сказаться на устойчивости клеток к апоптозу. Во-вторых, может происходить компенсаторная индукция других каспаз при отсутствии каспазы-2 или -3. Наконец, в механизме ВЦД-индуцированного разрушения фолликулов может доминировать каспаза-независимый механизм клеточной гибели, похожий на тот, что существует в других типах клеток вне яичника.

ИЗБРАННЫЕ ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКОГО ЗНАЧЕНИЯ АПОПТОЗА В ЯИЧНИКАХ

Апоптоз в гранулеза-лютеиновых клетках и вспомогательные репродуктивные технологии

В 1997 г нерандомизированное проспективное исследование на 129 овулирующих женщинах, подвергшихся процедуре ЭКО-ПЭ привело к выводам о том, что частота встречаемости апоптоза гранулеза-лютеиновых клеток в фолликулярных аспиратах была значительно выше у тех пациенток, у которых беременность в результате ЭКО не наступила, по сравнению с теми, у кого она удачно наступила. После этого последовали отчеты других исследований, обнаруживших обратную зависимость между апоптотическим индексом в клетках гранулезы и частотой наступления беременности. Действительно, в одном исследовании, включавшем 73 женщины, подвергшихся ЭКО-ПЭ, у тех, у кого наступила беременность, выраженность апоптоза в гранулеза-лютеиновых клетках была ниже, чем у тех, у кого беременность не наступила при отсутствии других видимых различий между группами (в возрасте, концентрации ФСГ, эстрадиола, уровне оплодотворения и числе перенесенных эмбрионов). Авторы предположили, что апоптотический индекс в гранулеза-лютеиновых клетках 6,14% или ниже может быть прогностическим критерием благоприятного наступления беременности с чувствительностью 87,5% и специфичностью 73,7%. Kaneko et al показали, что особенности протокола стимуляции значительно влияют на выраженность апоптоза в гранулеза-лютеиновых клетках: более высокий уровень отмечался у пациенток, получавших агонисты ГнРГ +ЧМГ и ЧХГ по сравнению с теми, кто получал только ЧМГ и ЧХГ или только ЧХГ в естественном цикле. Тот факт, что агонисты ГнРГ повышают уровень апоптоза в гранулеза-лютеиновых клетках, неудивителен, известно что они напрямую стимулируют апоптоз в культуре гранулезных клеток крыс и свиней и в человеческих гранулеза-лютеиновых клетках, полученных от пациенток с ЭКО. Количество агонистов ГнРГ, необходимое для стимуляции апоптоза, указанное в этих исследованиях, значительно ниже того, которое используется в протоколах стимуляции овуляции, что указывает на то, что применение агонистов ГнРГ во вспомогательных репродуктивных технологиях как помогает, так и мешает достижению конечной цели - благополучной беременности.

Функция яичников во время менопаузы

Одним из интригующих вопросов биологии является возможность регулирования апоптоза для пролонгирования нормальной функции яичников. Были проведены опыты на мышах для изучения идеи о том,что уменьшения скорости атрезии незрелых фолликулов сохранит и удлинит функциональную жизнь яичников. Изучали функцию проапоптотического протеина, Вах, с помощью стратегии генов-мишеней. Сравнительные исследования нормальных и лишенных bax мышей выявили, что потеря функции Bax не влияет на размер фолликулярного резерва при рождении, но значительно снижает скорость постнатальной атрезии примордиальных и первичных фолликулов. Конечным результатом становилось значительное удлинение «жизни» яичников. Исследования in vivo выявили, что пожилые bax-мутантные самки не становились беременными при совместном проживании с молодыми здоровыми самцами, поскольку несмотря на то, что мутантные самки способны образовывать большие антральные фолликулы, у них не происходит овуляция (отсутствует желтое тело). Эти находки предполагают, что у эти мышей произошло старение гипоталамо-гипофизарной системы, что подтверждается тем, что введение экзогенного гонадотропина вызывает полное созревание фолликула и овуляцию с формированием гистологически полноценного желтого тела. Более того, некоторые ооциты, полученные у пожилых мутантных, не имеющих bax самок, при суперовуляции, были способны к оплодотворению и предимплантационному эмбриогенезу in vitro. Возможность применения подобных работ в клинике противоречива - есть риск возрастания риска развития стероидо-зависимых злокачественных опухолей у женщин при продолжении фертильного периода, а также весь спектр проблем со здоровьем женщин возраста постменопаузы будет мешать использовать продолжающуюся функциональную активность яичников.

Сохранение фертильности при помощи S1P-терапии

Американское Общество по изучению рака оценило, что каждый год у 1 из 52 женщин в возрасте между рождением и 39 годами (пререпродуктивный и репродуктивный возраст) - диагностируется случай рака. Хотя некоторые из этих пациенток излечиваются с помощью хирургии, большинству назначается лучевая и\или химиотерапия. Т.о. количество людей, подверженных побочным эффектам противораковой терапии, огромно. В то время как необходимость эрадикации опухоли у таких пациенток очевидна, длительное воздействие лучевой и химиотерапии на окружающие ткани, в частности на яичники, где гибели подвергаются ооциты, - очень нежелательно. К сожалению, попытки сохранить фертильность и функцию яичников у женщин, больных раком, пока имеют скромный успех из-за недостаточного понимания механизмов нарушения функции яичников. В недавних исследованиях мы показали, что мышиные ооциты, обработанные доксорубицином, часто прописываемым химиотерапевтическим средством, не дегенерируют, а подвергаются апоптозу. Т.о. деструкция ооцитов, вызванная противоопухолевыми средствами, происходит по тем же основным механизмам, которые так желательны для протекания в опухолевых клетках. Таким образом, планируемый терапевический подход к борьбе с преждевременной яичниковой недостаточностью и бесплодием заключается в воздействии на ключевые компоненты сигнальных путей апоптоза ооцитов. Мы отметили, что некоторые отдельные сигнальные молекулы, включая церамид (генерируемый ASMазой), Вах и каспазы (особенно каспаза-2) необходимы для индукции апоптоза в ооцитах, подверженных химиотерапии доксорубицином in vitro. Более того, мыши, лишенные Вах, были устойчивы к овотоксичным эффектам доксорубицина in vivo. Терапевтические методы, направленные на сохранение женских половых клеток, должны быть технически доступны для использования человеком. Было предложено два подхода: генетическая терапия и молекулярная терапия. В первом исследовании у трансгенных мышей использовали промотер ооцит-специфического гена (zona pellucida-3 (ZP3)) для прямой сверхэкспрессии антагониста Вах - Bcl-2. Экспрессия трансгенного продукта определялась только в ооцитах. Избыток Bcl-2 протеина в ооцитах предупреждал атрезию фолликулов и усиливал резистентность к доксорубицин-индуцированному апоптозу.

Второй подход, более подходящий для клинического использования, основан на нашей предыдущей работе, показавшей, что S1P подавляет апоптоз с мышиных ооцитах, подвергшихся воздействию химопрепаратов in vitro. Антиапоптотический эффект S1Р в ооцитах нечувствителен к коклюшному токсину, что показывает, что как минимум активация Gi/o- EDG рецептора не задействована. Более того, дигидроS1P, связывающийся со всеми S1Р-рецепторами, известными на сегодня, не имитирует антиапоптотический эффект S1P на ооциты. Предположив, что S1P может так же действовать in vivo, мы оценили его эффективность в предотвращении яичниковой недостаточности у мышей, индуцированной радиотерапией. Результаты этого исследования показали, что выраженная деструкция ооцитов, вызванная облучением молодых взрослых самок, может быть полностью предотвращена предварительным введением S1P в околояичниковое пространство. Более того, защищенные ооциты оставались полностью способными к созреванию, оплодотворению и предимплантационному эмбриональному развитию in vitro.

Выбор S1P как терапевтической молекулы основан на эксперимантах, не только доказавших его антиапоптотическое действие на обработанные доксорубицином ооциты in vitro, но и выявивших внутриклеточные мишени для его воздействия. В частности, предыдущая работа выявила, что подавление каспазной активности в по меньшей мере некоторых моделях Вах-опосредованного апоптоза активирует неправильный механизм клеточной гибели путем первичного некроза, возможно потому, что митохондрии уже повреждены Вах каспаза-независимым способом. На основании исследований, показавших, что гибель ооцитов, индуцированная противоопухолевой терапией, Вах-зависима, каспазы перестали рассматриваться как возможные мишени для терапевтического воздействия, несмотря на тот факт, что их ингибиторы могут по меньшей мере временно подавлять гибель ооцитов, индуцируемую химиотерапией. Для достижения оптимального терапевтического эффекта подавления апоптоза в ооцитах был выбран «пре-Вах» (премитохондриальный) этап программы клеточной гибели - использование S1P для блокирования действия проапоптотической молекулы церамида.

В исследовании in vivo, взрослых самок мышей, облученных с или без предварительного введения S1P, помещали вместе с необлученными самцами - через 2 мес после облучения, а затем с 2-месячными интервалами, всего 4-кратно. Только 50% облученных нелеченных самок родили мышат после первого контакта, после четвертого - 12,5%. Среди леченных S1P - все мыши благополучно родили в первый раз и 75% оставались фертильны через год. Для определения, может ли сохранение функции яичников у облученных собей приводить к распространению геномных нарушений в поколениях, все 1 потомство от облученных леченных самок спарили с необлученными животными для получения второго поколения. Не было обнаружено значительных фенотипических или поведенческий отклонений у 500 особей F1 и F2. Более того, не было обнаружено значительных гистологических и биохимических отклонений у особей F1, умерщвленных в возрасте 18-20 мес, и у особей F2, умерщвленных в возрасте 12-16 мес.

Тем не менее, остается вероятной возможность субклинического повреждения, которое может передаваться по наследству. В качестве первичной проверки на повреждение ДНК в ооциитах самки F0 были обследованы через 8 нед после облучения. Не было обнаружено достоверного повышения доли ооцитов с повреждениями ДНК - хромосомные повреждения, конъюгация негомологичных хромосом - у особей, получавших S1P по сравнению с контрольной группой облученных мышей. Эит данные позволяют предположить, что облученные мыши, получвшие S1P, сохраняют бОльший резерв неповрежденных ооцитов для воспроизведения. Для дальнейшей оценки передачи повреждений ДНК в поколениях, испоьзовали частоту встречаемости микроядрышек как чувствительный индикатор распространения геномных повреждений. Не было обнаружено достоверной разницы в частоте встречаемости микроядрышек между группами леченных и нелеченных облученных мышей. Частота встречаемости микроядрышек в F1 и F2-потомствах от облученных леченных матерей была сходной с таковой в потомствах здоровых необлученных особей. Хотя необходимы дополнительные исследования, вероятность клинического применения S1P вполне близка, поскольку его защита половых клеток от радиотерапии не приводит к распространению геномных повреждений, что подтверждается на анатомическом, гистологическом, биохимическом и цитогенетическом уровнях.

Другие стратегии сохранения фертильности у пациенток со злокачественными опухолями Необходимо отметить, что альтернативные подходы к сохранению фертильности у пациенток с злокачественными опухолями тоже разрабатываются во многих лабораториях. Большинство этих исследований сфокусированы на аутотрансплантации криоконсервированной ткани яичников - процедура, проверенная на грызунах, овцах и недавно - на людях. Однако она имеет два принципиальных ограничения. Во-первых, процедура разработана для обеспечения кратковременного восстановления фертильности, а не для длительного сохранения функции яичников. Другими словами, пациентки будут продолжать страдать от преждевременной яичниковой недостаточности и всеми осложнениями здоровья, связанными с этим. Во-вторых, у пациенток с метастатическим раком, аутотрансплантация повышает риск возвращения раковых клеток вместе с трансплантируемой тканью яичника.

Другие исследования изучают возможность применения агонистов ГнРГ для блокирования яичниковой недостаточности, вызванной циклофосфамидом. Благополучные результаты получены для грызунах и макаках резус. Однако могут ли агонисты ГнРГ действительно сохранять фертильность у женщин, леченных от рака, остается неизвестным из-за небольшого числа и гетерогенности изучаемых групп. Защитный эффект агонистов ГнРГ в отношении женских половых клеток не выглядит универсальным феноменом, поскольку например в отношении облученных клеток они такого действия не оказывают. Возможно изучение использования комбинированной терапии - агонисты ГнРГ + S1P для осуществления более выраженной и длительной защит женских гонад от разрушительного действия химиотерапии и радиации.

Перевод Малярской М.М.