Лечение миомы матки агонистами гонадолиберина: активация повреждения и репарации ДНК, но не апоптоза

S.C.Huang, C.Y.Chou, Y.S.Lin, Y.C.Tsai et al.

Am. J Obstet Gynecol, 1997, 177: 417-424.

Лейомиома матки - опухоль, часто встречающаяся у женщин репродуктивного возраста. Клинически она может проявляться гиперменореей, бесплодием, а при больших размерах - симптомами сдавления соседних тазовых органов. При выраженной симптоматике методом выбора является хирургическое лечение миомы. Если женщина не заинтересована в своей фертильности, ей может быть рекомендована гистерэктомия. Если же пациентка хочет в будущем иметь детей, показана консервативная миомэктомия. Однако, эта операция чревата некоторыми осложнениями, могущими быть факторами бесплодия, в частности, повреждением эндометрия и возникновением спаек [1].

Известно, что агонисты гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ), вводимые один раз в месяц, значительно уменьшают размеры миомы и уровень эстрадиола сыворотки. Уменьшение диаметра узла, особенно заметное в первые 2 мес терапии агонистами ГнРГ, делает процедуру миомэктомии более легкой в техническом исполнении и снижает частоту возможных осложнений [2-4]. Терапия агонистами ГнРГ, помимо снижения уровня эстрадиола в сыворотке, уменьшает продукцию некоторых трофических факторов, таких как инсулин-подобный фактор роста 1 (ИПФР-1) и эпидермальный фактор роста (ЭФР), а также ухудшает маточное кровоснабжение, что в совокупности нарушает рост миоматозных узлов [5-7]. Однако, сегодня известно, что максимальный эффект агонистов ГнРГ достигается к 3-4 месяцу. Далее, даже если лечение продолжать, скорость инволюции миоматозного узла снижается [8]. Вышеописанными фактами невозможно объяснить это явление. Т.о., до сих пор точно не известен механизм действия агонистов ГнРГ на лейомиому матки.

Известно, что резкое снижение уровня андрогенов после кастрации значительно усиливает апоптоз в клетках железистого эпителия простаты [9]. Кроме того, в этих клетках обнаружено повышенное содержание ядерного антигена клеточной пролиферации (АКП), что связывают с репликацией [9] или репарацией поврежденной ДНК [10]. Поскольку агонисты ГнРГ вызывают медикаментозную кастрацию, возможно, при их приеме в клетках лейомиомы происходят подобные процессы.

Целью настоящего исследования было изучить гистопатологические механизмы действия агонистов ГнРГ на миому матки. Определяли уровень клеточной пролиферации по экспрессии АКП и с помощью моноклональных антител (MIB-1) к антигену пролиферации Ki-67, степень апоптоза и плотность микрососудов в ткани миомы. У 9 пациенток из 15 определяли содержание фрагментированной ДНК в клетках миомы.

Результаты

У 15 пациенток, получавших терапию агонистами ГнРГ, показанием к операции было увеличение размеров матки, сопровождающееся следующими симптомами: бесплодие в анамнезе (7 пациенток), длительная гиперменорея (6 пациенток), пальпируемая опухоль (2 пациентки). Средний возраст составил 33,1± 5,5 лет. Симптомы, ответ на терапию и результаты определения АКП представлены в Табл. 1. Средний объем миомы до лечения составлял 277,5 ± 280,2 мл, после - 125,8 ± 143,8 мл. Эти значения достоверно не отличались от таковых в контрольной группе, не получавшей терапию агонистами ГнРГ до операции (174,7 ± 192,0 мл, р > 0,05). На терапию агонистами ГнРГ 12 пациенток ответили удовлетворительно (объем миомы меньшился более, чем на 39%). У 3 пациенток объем уменьшился менее, чем на 20%, что было расценено как неудовлетворительный ответ на терапию.

У 44 пациенток контрольной группы показанием к операции тоже служило увеличение матки со следующими клиническими проявлениями: продолжающаяся гиперменорея или дисменорея (у 27), симптомы сдавления соседних органов или боль (у 12), быстрый рост опухоли (у 7) и сочетание признаков (у 2). 4 пациенткам проведена миомэктомия, 40 - гистерэктомия. Выбор объема операции основывался на возрасте и желании пациентки иметь детей в будущем. Средний возраст пациенток составил 42,0 ± 4,9 лет. Возрастные различия между группами с лечением агонистами ГнРГ и без были достоверными (р < 0,0001), т.е. пациентки, получавшие агонисты ГнРГ были более молодыми и имели бесплодие в анамнезе. Однако, в обеих группах не прослеживалась корреляция между возрастом и результатами иммунногистохимических исследований.

Результаты определения уровня АКП, апоптоза и фрагментов ДНК у пациенток обеих групп представлены в Табл. 2. Из 5 пациенток, получавших терапию агонистами ГнРГ, у одной после приема 4 доз препарата объем опухоли уменьшился всего на 39%. На гистологическом исследовании обнаружена гиалиновая дегенерация миоматозного узла и отсутствие клеток. Этот случай был исключен из дальнейшего анализа. При определении уровня АКП выявлено, что у 6 пациенток более 50% клеток миомы имели этот антиген, у 4 пациенток - 20-50% клеток, у 4 - менее 5% клеток. Примечательно, что у всех трех пациенток с отсутствием ответа на терапию агонистами ГнРГ, было менее 5% АКП-позитивных клеток. Несмотря на то, что в большинстве образцов миомы после терапии была обнаружена 3-4 степень АКП, интенсивность окраски была ниже по сравнению с лимфоцитами из гиперплазированного лимфоузла (Рис.1). Препараты напоминали картину, характерную для G1 фазы клеточного цикла и репарации ДНК, а также - для непролиферирующих гепатоцитов при воспалении или метастатическом поражении [12, 18]. В качестве контроля были взяты гепатоциты при хроническом активном гепатите. При высоком уровне АКП в клетках миомы не было ни некроза, ни значительных воспалительных инфильтратов. Из 44 пациенток, не получавших терапию гонистами ГнРГ, у 2 была 4 степень АКП, у 13 - 3, у 20 - 2, у 9 - 1. Анализ методом "хи-квадрат" выявил, что уровень экспрессии АКП значительно возрастает после терапии агонистами ГнРГ (р = 0,0004). Противоречащие результаты получены при исследовании степени клеточной пролиферации путем определения MIB1: выявлено, что менее 0,3% клеток миомы пролиферируют, даже если проводилась терапия агонистами ГнРГ, более того, в этой группе (с агонистами) пролиферирующие клетки обнаруживались чаще, чем в контроле (0,075% ± 0,0912% и 0,002% ± 0,01%, соответственно, р < 0,0002).

Значение плотности микрососудов в группе с лечением агонистами ГнРГ составляло 65,5 ± 31,04, а в контрольной группе - 41,97 ± 28,19 (р = 0,01). Такое повышение плотности микрососудов после терапии агонистами ГнРГ может быть вызвано уменьшением общего объема опухоли, а не увеличением абсолютного числа сосудов. Этот вопрос требует дальнейших исследований.

Результаты изучения степени апоптоза показали, что клетки лейомиомы вступают в апоптоз спонтанно (Рис.2), независимо от проводимого лечения агонистами ГнРг (достоверной разницы между группами не обнаружено, р > 0,05). Определение фрагментов ДНК в 9 образцах ткани подтвердило идею спонтанности апоптоза и его независимости от лечения агонистами ГнРГ (Рис.3)

Выводы

Настоящее исследование показало, что агонисты ГнРГ в клетках лейомиомы матки значительно повышают экспрессию АКП, а также Кi-67 антигена, хотя АКП-позитивых клеток несоизмеримо больше. Более того, степень экспрессиия АКП соответствует силе ответа на лечение агонистами ГнРГ. Апоптоз в клетках лейомиомы происходит спонтанно, и его частота не изменяется после лечения агонистами ГнРГ. Плостность микрососудов после лечения агонистами ГнРГ возрастает, хотя достоверность и механизм этого явления необходимо уточнить.

АКП, ядерный белок с молекулярной массой 36кД, является необходимым компонентом в механизме клеточного деления [19]. АКП экспрессируется неделящейся клеткой во время репарации поврежденной ДНК [20] или после стимуляции факторами роста или цитокинами [12, 21]. Некроз и воспалительные инфильтраты можно объяснить активацией местных факторов роста и цитокинов, обуславливающих повышенную экспрессию АКП. Введение ЭФР in vivo вызывало повышение экспрессии АКП на неделящихся клетках [21]. Поскольку характер экспрессии АКП соответствует таковому для непролиферирующих клеток в стадии G1 при репарации ДНК, и т.к. клеток, экспрессирующих АКП, неизмеримо больше в ткани миомы, чем пролиферирующих, можно предположить, что экспрессия АКП на фоне терапии агонистами ГнРГ не является следствием клеточной пролиферации. После лечения этими препаратами не выявляется воспалительных инфильтратов и некроза. Замечено также, что агонисты ГнРГ значительно снижают связывание ЭФР тканями матки [5]. Все вместе, эти данные позволяют предположить, что повышение экспрессии АКП после терапии агонистами ГнРГ вызвано именно репарацией ДНК, следующей за ее повреждением.

В предыдущих исследованиях показано, что агонисты ГнРГ способствуют развитию гипоэстрогении [2-4] и снижают уровень факторов роста [5, 6] и кровоснабжение матки [7]. В этих условиях усиливается повреждение ДНК. Деление клеток с поврежденной ДНК блокируется [22, 23], и активируется система репарации ДНК [23, 24]. Если репарации ДНК не происходит, клетка погибает [25]. Наши результаты позволяют также предположить, что механизм действия агонистов ГнРГ отличается от влияния андрогенной недостаточности на клетки предстательной железы. Во-первых, в отличие от отсутствия андрогенов, вызывающего фрагментацию ДНК и неполноценную ее репарацию, что ведет к усилению апоптоза в клетках железистого эпителия простаты [9], повреждения ДНК, вызванные агонистами ГнРГ, эффективно восстанавливаются, и таким образом, частота апоптоза не увеличивается. Во-вторых, фракция пролиферирующих клеток, хотя и незначительно, но, все-таки, растет на фоне терапии агонистами ГнРГ. В противоположность этому, процент раковых клеток, экспрессирующих Ki-67 антиген (пролиферирующих), снижается у больных с метастатическим раком простаты на фоне отсутствия андрогенов [26]. Видимо, в отличие от андрогенов, которые можно полностью удалить из организма, на фоне приема агонистов ГнРГ в используемых терапевтических дозах не происходит полной кастрации, и некоторый уровень секреции эстрадиола остается.

Хотя в нашем исследовании было очень мало пациенток, не давших ответа на терапию агонистами ГнРГ, у всех них выявлено менее 5% АКП-позитивных клеток. Это позволяет утверждать, что уровень экспрессии АКП свидетельствует о выраженности ответа на терапию. Конкретный механизм такого соответствия требует своего изучения.

Результаты исследования апоптоза и фрагментации ДНК показывают, что апоптоз в клетках миомы развивается спонтанно и не зависит от терапии агонистами ГнРГ. Наши данные не совпадают с идеей о том, что апоптоз играет важнейшую роль в механизме действия рассматриваемых препаратов. Электронно-микроскопическое исследование также не обнаружило каких-либо признаков апоптоза в клетках миомы после терапии агонистами ГнРГ [27].

В литературе имеются данные о том, что количество митозов в клетках лейомиомы не возрастает после лечения агонистами ГнРГ [28, 29]. Однако, количество митозов сегодня не рассматривается как жесткий показатель уровня пролиферации [30]. На сегодняшний день быстрым и информативным маркером, позволяющим определить пролиферирующие нормальные и раковые человеческие клетки в гистологических срезах, является антиген Ki-67. MIB 1 - это моноклональные антитела к Ki-67 [31]. Наши результаты показывают, что среди клеток лейомиомы почти нет пролиферирующих. Однако, те, что есть, чаще встречаются в группе пациенток, принимавших агонисты ГнРГ. Это небольшое, но важное повышение количества пролиферирующих клеток вместе с повышением уровня репарации ДНК на фоне терапии агонистами ГнРГ может объяснить тот факт, что уменьшение размеров миомы рано или поздно прекращается, даже при продолжении приема препаратов.

Т.о., можно заключить, что повышение степени повреждения и репарации ДНК с экспрессией АКП являются результатом действия агонистов ГнРГ, в то время как апоптоз клеток лейомиомы не связан с действием этих препаратов. Более того, процент АКП-позитивных клеток можно считать диагностическим критерием ответа на терапию агонистами ГнРГ. Большинство клеток миомы не пролиферируют, однако на фоне приема агонистов ГнРГ пролиферация несколько активируется.

Перевод Малярской М.М.