Иммунологические тесты в оценке репродуктивных расстройств: обзор литературы

C.B.Coulam

Am J Obstet Gynecol, 1992, Vol. 167, No6, p. 1844-1851

Самопроизвольный аборт - наиболее частое осложнение беременности. 2-5% супружеских пар бездетны по причине привычного невынашивания. После исключения генетических, анатомических, гормональных причин остаются случаи неясной этиологии. Иммунологические факторы предполагаются причиной более 80% невынашивания неясной этиологии. Поскольку беременность связана с индукцией и адаптацией материнских аллогенетических механизмов, неадекватный ответ на аллоантигены и предполагается как причина невынашивания. Лабораторные тесты, предложенные для подтверждения диагноза аллоиммунного характера невынашивания, включают в себя HLA-типирование, определение материнских лимфоцитотоксических антител против антигенов отца, блокирующих антител к культуре смешанных лейкоцитов.

О том, что эти лабораторные исследования могут быть также полезны при диагностике бесплодия, свидетельствует то, что 85% беременностей прерываются до факта их установления. Предполагается, что привычное невынашивание и бесплодие являются проявлениями существующих иммунологических расстройств.

Материал и методы исследования

В исследование включено 744 супружеских пар (609 с привычным невынашиванием в анамнезе, 92 - с бесплодием и 43 фертильные пары).

На основании изучения акушерского анамнеза пары с невынашиванием беременности разделены на группы с первичным и вторичным невынашиванием. В группу с первичным невынашиванием выделены женщин, никогда не донашивавшие беременность до 20 недель, со вторичным - женщины, имеющие детей или с мертворождением после 20 нед.

В парах с бесплодием длительность последнего составляла 3 и более года, возможные причины были исключены с помощью следующих методов: УЗИ-мониторинг фолликулогенеза, определение ЛГ в моче, биопсия в лютеиновую фазу, определение сывороточного уровня прогестерона, спермограмма, гистеросальпингография, лапароскопия, определение антиспермальных антител, антифосфолипидных антител, АЧТВ.

Контрольная группа состояла из 43 добровольцев. Фертильность контрольной группы определялась как наличие у женщин 2 или и более благополучно закончившихся беременностей, наступавших в течение года половой жизни без предохранения. У женщин контрольной группы с тремя и менее беременностями не было спонтанных абортов в анамнезе, с четырьмя и более - мог быть один спонтанный аборт.

У всех женщин производили забор крови для типирования HLA, определения лимфоцитотоксических антител и блокирующих антител к культуре смешанных лимфоцитов (РСЛ).

HLA-типирование.

Производили типирование HLA-А, - B, - C, -DR-антигенов лимфоцитов периферических лимфоцитов мужа и жены. Для типирования HLA-DR производили забор В-клеток после пассажа лимфоцитов периферической крови через нейлоновую ткань.

Анализ лимфоцитотоксичности.

Исследование иммунитета жены против антигенов мужа определяли с помощью двух комплемент-зависимых исследований цитотоксичности: стандартного визуального анализа лимфоцитотоксичности с окрашиванием эозином, и модифицированным исследованием цитотоксичности, основанным на выделении Сr51. Применяли также дополнительный анализ для определения комплемент-независимой, антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности. Мишенями для всех тестов были использованы лимфоциты мужа, антитела брали из сыворотки жены. Цитотоксичность более 20% методом окрашивания эозином, выделение Cr51 на 10% больше, чем спонтанное, рассматривались как положительные результаты тестов на цитотоксичность.

РСЛ.

Для изучения способности моноцитов периферической крови жены реагировать с клетками мужа в РСЛ проводили следующие тесты: взаимодействие клеток жены с клетками мужа (А), с клетками пациентов контрольной группы (В), взаимодействие клеток пациентов контрольной группы с клетками жен и с клетками мужей. Каждая культура состояла из 100000 клеток реципиента в 0,1 мл питательной среды, смешанной со 100000 клетками донора в 0,1 мл питательной среды. Культуры культивировали в инкубаторе в присутствии воздуха с 5% диоксида углерода при температуре 37 градусов в течение 6 дней. За 18 часов до окончания культивирования в каждую культуру добавляли по 2мкКи тимидина, меченного тритием. Затем подсчитывали степень захвата тимидина в минуту. Предварительные исследования показали, что лимфоциты жен из группы с невынашиванием отвечают на клетки мужей слабее, чем на лимфоциты пациентов контрольной группы. Рассчитывали относительные величины (ответ лимфоцитов жены на лимфоциты мужа (уровень захвата в минуту)/ответ лимфоцитов жены на лимфоциты пациента контрольной группы, %). Т.е., например, если ответ лимфоцитов жены на клетки мужа составляет 1000 захватов в минуту, а на клетки пациентов из группы контроля - 10000 захватов в минуту, то относительная величина составляет 10%, т.е. лимфоциты жен отвечают на клетки мужа в 10 раз слабее, чем на клетки пациентов из группы контроля.

Для определения ингибиторов культуры смешанных лимфоцитов проводили вышеуказанные тесты с использованием сыворотки жены и сыворотки пациенток контрольной группы. Если при использовании сыворотки жены ответ был как минимум в 2 раза меньше, чем при использовании контрольной сыворотки, присутствие ингибиторов реакции смешанных лимфоцитов считалось доказанным.

Сравнительный анализ.

Частоту совместимости по двум и более HLA-антигенам, присутствие лимфоцитотоксических антител против лимфоцитов мужа, ингибиторов реакции смешанных лимфоцитов (РСЛ) в парах с привычным невынашиванием и бесплодием сравнивали с контрольной группой.

Результаты

В табл. 1 представлены клинические характеристики женщин, принимающих участие в исследовании. Средний возраст женщин с бесплодием составил 33 года (21-42), фертильных - 35 (22-42), с привычным невынашиванием - 33 (21-42). Количество беременностей составило 4,3 (2-11) среди женщин с привычным невынашиванием, 4,6 (2-9) среди женщин контрольной группы, 0,9 (0-5) среди женщин с бесплодием. Из 92 женщин с бесплодием у 41 оно было первичным, у 51 - вторичным. Среднее число беременностей у женщин со вторичным бесплодием составило 2,0.

Типирование HLA.

Результаты этого исследования представлены в табл. 2. Частота совместимости по двум и более HLA-A, -B, -C, -DR антигенам среди пар с привычным невынашиванием составила 41%, причем разницы между подгруппами с первичным и вторичным невынашиванием не выявлено, так же как между группой с невынашиванием и контрольной. Также не было выявлено различий по совместимости HLA-антигенов мужду группой женщин с лимфоцитотоксическими антителами и без них.

Среди 92 обследованных супружеских пар, у 31 (34%) обнаружена совместимость по двум и более HLA-A, -B,-C-, -DR антигенам (табл.2) и у 3 (3%) - по более чем одному HLA-DR антигену. У 4 из 49 (8%) пар с первичным бесплодием была совместимость по одному антигену HLA-DQ, у 7 из 43 (16%) пар с вторичным бесплодием - по HLA-В. Всего у 14 из 92 (15%) пар были обнаружены сочетания HLA, ранее описанные для бесплодных пар. Частота встречаемости совместимости не отличалась между группами бесплодных и фертильных пар.

Лимфоцитотоксические антитела

Лимфоцитотоксические антитела против отцовских антигенов были обнаружены в сыворотке 63% (27/43) фертильных женщин, 26% (160/609) женщин с привычным невынашиванием, 8% (7/92) бесплодных женщин.

Среди женщин с привычным невынашиванием отмечалась достоверная разница уровня антител между группами с первичным (16%) и вторичным (51%) невынашиванием (р < 0,0001). Также уровень лимфоцитотоксических антител был достоверно ниже в группе с первичным невынашиванием по сравнению с контрольной группой. Между группой с вторичным невынашиванием и контрольной достоверных различий в уровне антител не было (р=0,21).

У 7 из 92 (8%) женщин с бесплодием обнаружены лимфоцитотоксические антитела против антигенов мужа. У 5 из этих 7 женщин было вторичное бесплодие (12% среди женщин с вторичным бесплодием), у 2 - первичное (4% женщин с первичным бесплодием). Частота встречаемости лимфоцитотоксических антител против антигенов мужа в группе с бесплодием был достоверно ниже, чем в фертильной группе (p < 0,0001).

Встречаемость лимфоцитотоксических антител повышалась параллельно числу беременностей в анамнезе (от 4% у нерожавших женщин до 75% у женщин, имевших 4 и более беременностей, закончившихся родами). У женщин контрольной группы был более высокий уровень антител, чем у женщин с привычным невынашиванием.

Продолжительность беременности была зафиксирована в акушерских историях 449 женщин (314 с привычным невынашиванием, 92 с бесплодием, 43 контрольной группы). На рис. 3 представлен уровень лимфоцитотоксических антител против антигенов отца как функция от общей продолжительности беременностей за жизнь. Частота встречаемости антител повышалась от 4% у женщин с первичным бесплодием до 75% у женщин с общей продолжительностью беременности за жизнь более 160 недель.

Реакция смешанных лимфоцитов

Частота встречаемости ингибиторов РСЛ на лимфоциты мужа в сыворотке женщин также возрастала параллельно с общим временем беременности. 4% (4/92) бесплодных женщин, 20% (122/609) женщин с привычным невынашиванием, 44% (19/43) женщин контрольной группы имели ингибиторы РСЛ. (рис. 4). Уровень встречаемости ингибиторов РСЛ возрастал параллельно с числом беременностей за жизнь (рис. 5). У фертильных женщин отмечена большая частота встречаемости ингибиторов РСЛ, чем у женщин с первичным невынашиванием (р < 0,0001), но не отличалась от таковой у женщин с вторичным невынашиванием (р=0,61) (рис.5). У всех бесплодных женщин с наличием ингибиторов РСЛ было вторичное бесплодие.

При сравнении уровня встречаемости ингибиторов РСЛ у 449 женщин с общим временем беременности за жизнь, отмечено повышение от 4% у женщин с первичным бесплодием до 75% женщин с более чем 160 неделями (рис. 6).

Обсуждение

Анализ полученных данных демонстрирует, что частота совместимости по HLA не взаимосвязана с репродуктивной функцией, а также что присутствие лимфоцитотоксических антител потив антигенов отца ингибиторов РСЛ представляет собой ответ материнского организма на имеющуюся беременность. Однако ни один из рассмотренных лабораторных тестов не может претендовать на достоверное прогнозирование исхода беременности. Было продемонстрировано отсутствие связи между результатами этих тестов и исходом беременности, независимо от лечения иммуноцитотерапией лимфоцитами мужа.

Предположение о неблагоприятном воздействии совместимости по HLA-антигенам на исход беременности было сделано на основании опытов на мышах и людях. Положительный исход беременности встречался чаще у мышей с несовместимостью по антигенам основного комплекса гистосовместимости. Показано, что среди инбредных мышей выживают очень немногие линии, либо частично гетерозиготные, либо с высоким уровнем мутаций. Интересен факт существования инбредных линий без полиморфизма антигенов основного комплекса гистосовместимости. Это может свидетельствовать о значении других генов. Первые отчеты по исследованию совместимости и гомозиготности по HLA-антигенам позволили заподозрить взаимосвзяь этих фактов с привычным невынашиванием у людей. Дальнейшие исследования, включая настоящее (табл. II), показали отсутствие взаимосвязи между совместимостью по HLA и исходом беременности. Частота совместимости по HLA в контрольной группе (65%) была выше, чем отмесалось ранее (31%). Число изучаемых пар в контрольной группе было небольшим (n=43), это и может объяснить высокую степень совместимости. Однако важно отметить, что даже в исследованиях, показывающих большую степень совместимости по HLA в парах с привычным невынашиванием по сравнению с фертильными парами, было отмечено что у большинства пар с привычным невынашиванием не было совместимости по HLA и наоборот, наличие совместимости не означало прерывания благоприятно протекающей беременности. Поскольку отсутствие совместимости по HLA не является необходимым условием вынашивания (табл. II), гетерозиготность плода по этим антигенам также не является необходимым условием. Т.о. типирование HLA не является необходимым исследованием при привычном невынашивании.

Индукция материнским организмом антител, направленных протв лейкоцитарных антигенов, как ответ на аллостимуляцию является известным феноменом у млекопитающих. Серологические исследования показывают, что эти антитела часто обладают цитотоксическими свойствами и часто направлены против отцовских аллоантигенов. Из этого был сделан вывод об отрицательном действии этих антител на имплантацию и вынашивание, однако доказательств этого предположения не существует. На самом деле некоторые исследователи полагают, что присутствие лимфоцитотоксических антител является прогностическим фактором благоприятного исхода беременности. В настоящем исследовании у фертильных женщин лимфоцитотоксические антитела против антигенов отца обнаруживаются чаще, чем у бесплодных (р < 0,0001). Уровни лимфоцитотоксических антител в порядке убывания: у фертильных женщин, женщин с вторичным невынашиванием, первичным невынашиванием, вторичным бесплодием, первичным бесплодием (рис.1). Частота встречаемости лимфоцитотоксических антител возрастала параллельно с общей продолжительностью беременности за жизнь.

Взаимосвязь между уровнем антител и общей продолжительностью и числом беременностей (рис.2, 3) поддерживает концепцию благоприятного влияния лимфоцитотоксических антител на исход беременности.

Блокирование потенциального механизма отторжения аллотрансплантата материнской иммунной системой рассматривается как механизм сохранения благополучной беременности. РСЛ используется в качестве in vitro модели аллогенных реакций. Сывороточные факторы, ингибирующие РСЛ, считаются необходимыми для процесса репродукции. Однако блокирующая активность не всегда определяется в сыворотке женщин с нормальной беременностью. Кроме того, возможна нормальная беременность при агаммаглобулинемии у мышей и людей. Как и присутствие лимфоцитотоксических антител против антигенов отца, присутствие ингибиторов РСЛ более часто обнаруживается в сыворотке фертильных, чем бесплодных женщин (р < 0,0001) (рис. 4) и взаимосвязано с общей продолжительностью и числом беременностей за жизнь. (рис. 5, 6). Т.о., создается впечатление скорее положительной, чем отрицательной роли ингибиторов РСЛ, так же как и лимфоцитотоксических материнских антител против антигенов отца, для процессов репродукции.

Наличие лимфоцитотоксических антител и ингибиторов РСЛ является следствием числа и продолжительности беременностей. Этот вывод можно сделать на основании анализа акушерских историй. Частота совместимости по HLA между супругами и уровень лимфоцитотосических антител и ингибиторов РСЛ не являются прогностическими факторами исхода беременности. Т.о. эти исследования не показаны при поиске причин бесплодия и невынашивания. Существует одно возможное исключение. Если рассматривать иммуноцитотерапию как лечебную меру, лицам с уже имеющимися лимфоцитотоксическим антителами против антигенов мужа, она не показана.

Необходимо использование более чувствительных и специфичных тестов для определения пар с иммунологическими причнами невынашивания, чем определение ингибиторов РСЛ. Например поиск антител к трофобласту (не анти-HLA). Они направлены против аллогенных неспецифических детерминант, перекрестных с антигенами, с молекулярной массой 80 кД. определение этих антител может оказатся более специфическим методом исследования адекватности аллогенного ответа.

Перевод Малярской М.М.