Иммунология привычного невынашивания

Подборка тезисов и статей по теме “Иммунология привычного невынашивания” (перевод Малярской М.М.)

Иммунология привычного невынашивания

The female Patient, Vol 20, feb 1995. P. 1-4

P.J.Chong, W.L.Matzner, W.T.W.Ching

Обзор

Традиционно рассматривались четыре основные причины привычного невынашивания: инфекции, хромосомные аномалии, недостаточность прогестерона и анатомические дефекты. Однако сегодня известно, что большинство привычных выкидышей вызваны иммунными нарушениями, в частности наличием материнских антител к лейкоцитам отца; антифосфолипидных антител; антинуклеарных антител. Для лечения иммунных нарушений используют иммунизацию лейкоцитами мужа, гепаринотерапию, низкие дозы аспирина и преднизолона. При вовремя назначенном и тщательно подобранном лечении эффективность достигает 80%.

Введение

Иммунология репродукции - очень динамичная область медицины, стремительно развивающаяся. Иммунные механизмы задействованы в патогенезе бесплодия, эндометриоза, гестоза, невынашивания и других аспектов репродукции. Данный обзор посвящен иммунологии привычного невынашивания. Классически привычным невынашиванием принято называть ситуацию трех или более последовательных невынашиваний беременности, однако многие практические врачи подразумевают под этим термином невынашивание более одной беременности.

Причины привычного невынашивания: инфекции (1%), анатомические дефекты (5-10%), недостаточность лютеиновой фазы (5-20%), хромосомные аномалии (7-50%), иммунные механизмы (50%), неизвестные причины (15%). У некоторых женщин имеется несколько причин привычного невынашивания. Обследование, включающее УЗИ, гистеросальпингографию, лапароскопию, биопсию эндометрия, хромосомный анализ клеток родителей и плодов, измерение уровня прогестерона, позволяет обнаружить причину только в 50% невынашивания. Имеются основания предполагать, что оставшиеся неизвестные причины имеют иммунные механизмы.

Эндометрий - это загадка. Несмотря на полный набор иммунокомпетентных клеток, он позволяет аллотрансплантату существовать в нем в течение 40 недель. Во время беременности фетоплацентарный комплекс осуществляет иммунные влияния посредством Т и В лимфоцитов, естественных киллеров, разнообразных молекулярных факоров (цитокинов) и антител. В значительной степени взаимодействие между фетоплацентарными тканями и иммунной системой определяет успешное окончание беременности. Три вида антител важны для вынашивания: материнские антитела против отцовских лейкоцитов (APLA, блокирующие антитела), антифосфолипидные антитела (АРА), антинуклеарные антитела (АNА).

При иммунной причине невынашивания шанс доносить беременность составляет 30% после 3 выкидышей (без врачебных вмешательств), 25% после 4 выкидышей, 5% после 5 выкидышей. При адекватной терапии шанс благополучного исхода беременности составляет 70-85%.

Антитела к отцовским лейкоцитам

APLA - антитела, блокирующие HLA-антигены отца, экспрессируемые плодом, от эффекторных клеток иммунной системы матери. Гены HLA-системы расположены в 6 хромосоме. HLA состоит из антигенов I и II классов. Антигены I класса, включающие А-, В- и С-локусы, обнаруживают на всех клетках, содержащих ядро, тромбоцитах, и являются единственными антигенами HLA, экспрессируемыми на неактивированных Т-лимфоцитах. Позже был описан другой класс HLA I типа - класс G, экспрессирующийся на цитотрофобласте в отличие от синцитиотрофобласта, не экспрессирующего вовсе антигенов HLA. Исследования с помощью ПЦР показали, что плацентарный барьер проходим для клеток, т.о. материнские клетки могут обнаруживаться в кровотоке плода и наоборот.

Более ограниченное число клеток (В-лимфоциты, макрофаги, моноциты, активированные Т-лимфоциты) экспрессируют антигены II класса, занимающие локусы DR, DQ, DP. Полиморфизм HLA достаточен для обеспечения иммунологической индивидуальности (Табл. 1). В-клетки отвечают за гуморальное звено иммунного ответа, продуцируя антитела. При наступлении беременности, лимфоциты эндометрия вырабатывают APLA-антитела против отцовских HLA-антигенов. APLA обнаруживают уже на 5 неделе гестации, они защищают плод от материнских естественных киллеров, способствующих отторжению эмбриона.

При обследовании супружеских пар с привычным невынашиванием изучают степень их совместимости по HLA - чаще всего по локусам В, DR и DQ. Недостаточные различия по этой системе нарушают продукцию аллоантител. У многорожавших женщин обнаруживают циркуляцию APLA и вне беременности, в то время как у женщин с привычным невынашиванием уровень антител низкий или вовсе не определяется (табл.2).

В парах с привычным невынашиванием уровень APLA определяют с помощью методики цитофлуометрии. Лимфоциты мужа смешивают с сывороткой жены и инкубируют с иммунофлюоресцентными метками. Образец помещают в цитофлуориметр. Под излучением аргонового лазера клетки с прикрепившимся к ним APLA начинают флюоресцировать. Компьютер улавливает и измеряет интенсивность свечения.

Наличие APLA также может быть подтверждено напрямую путем измерения микроцитотоксичности и реакции смешанных лимфоцитов (MLR). Недостатки этих методик связаны с их зависимостью от различных факторов; например, первая определяет только те антитела которые фиксируют комплемент, а MLR зависит от свойств культуры. На сегодняшний день эти методики не используются для прогнозирования исхода беременности.

Лечение заключается в иммунизации матери концентрированной культурой лимфоцитов мужа, таким образом, что антигенная нагрузка увеличивается в 10000 раз по сравнению с нормой в ранние сроки беременности. Иммунизация лимфоцитами мужа происходит обычно в течение 4 недель. Через 4 недели после второй процедуры измеряют уровень APLA. Если он значительно повышается перед зачатием, успешное вынашивание достигает 80% (Табл. 3). Эффективность использования различных мономеров человеческих гамма-глобулинов в настоящий момент изучается.

Процедура иммунизации лимфоцитами мужа сопряжена с риском передачи инфекций, таких как гепатиты А, В, С, ВИЧ, вируса Т-клеточного лейкоза. Кровь донора тестируется на эти вирусы с помощью рутинных методик. В редких случаях возможно занесение инфекции в место инъекций и развитие воспаления подкожной клетчатки. Иммунизация лимфоцитами мужа стимулирует продукцию аллоантител, но не аутоантител, развитие аутоиммунных состояний после этой процедуры не зафиксировано.

Антифосфолипидные антитела

Молекулы фосфолипидов являются нормальными компонентами клеточных мембран. Антитела к фосфолипидам обнаруживаются при многих патологических состояниях. Они способны повреждать клетки эндотелия и мембрану тромбоцитов, ингибировать синтез простациклинов и нарушать активацию протеина С. Результатом является повышение адгезии тромбоцитов и относительное увеличение уровня тромбоксана, что в целом повышает частоту тромбозов. Происходя в сосудах маточно-плацентарного комплекса, тромбозы приводят к потере беременности или к внутриутробной задержке развития плода.

Некоторые фосфолипидные молекулы, в частности, фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин, обладают адгезивными свойствами. Они позволяют клеткам слипаться друг с другом, так, например, в плаценте из цитотрофобласта образуется синцитиотрофобласт, регулирующий питание плода. Изучение формирования синцития на культуре клеток трофобласта линии Be-Wo выявило, что моноклональные антитела к фосфатидилсерину (но не к кардиолипину!) ингибируют этот процесс in vitro. Более того, в плацентах пациенток с АРА и невынашиванием обнаруживают высокий уровень АРА класса IgM, связанных с синцитием. Блокирование клеточной адгезии антифосфолипидными антителами нарушает процесс имплантации.

При выкидышах на ранних сроках имеется 10% вероятности образования АРА у матери, причем эта вероятность повышается с каждой беременностью. У большинства женщин присутствие АФА бессимптомно. При наличии АРА и клинике тромбозов ставится диагноз АФС.

Лечение АРА включает в себя низкие дозы аспирина и профилактику гепарином, который не проходит через плаценту из-за большой молекулярной массы. Гепарин активирует образование антитромбина III, который блокирует каскад свертывания. Аспирин проникает через плаценту, но низкие дозы не могут повредить плоду. Аспирин блокирует циклооксигеназу и образование тромбоксана, не мешая действию постациклина. Лечение более эффективно, если начато до зачатия и продолжается в течение всей беременности.

Антинуклеарные антитела

Повышается частота встречаемости АNА у женщин с привычным невынашиванием. Причина появления этих антител в настоящий момент изучается, предполагается генетическая предрасположенность, определяемая фенотипом HLA. Состояние, наиболее часто сочетающееся с наличием АNА, - СКВ, при которой риск невынашивания очень высок - около 50%. Хотя у большинства женщин с привычным невынашиванием нет всех критериев СКВ, некоторые волчаночно-подобные признаки встречаются. У таких пациенток часто обнаруживает повышенная активность поликлональных В-клеток. Патоморфологическое исследование плаценты показывает воспалительные изменения в ворсинках, сосудах плаценты и слизистой матки при наличии АNА.

Когда присутствие ANA сочетается с привычным невынашиванием, назначают преднизолон для подавления воспаления и стабилизации клеточных мембран. Преднизолон не проходит свободно через плаценту, поскольку в значительной степени связывается альбумином, довольно крупной белковой молекулой. Кроме того, в плаценте содержится бета-2-дегидрогеназа, разрушающая преднизолон. Подавление надпочечников плода не было зафиксировано. При наличии показаний преднизолон назначают до зачатия. Адекватное лечение позволяет доносить беременность в 80-85%.

Заключение

Нарушения иммунного ответа организма матери на аллотрансплантат тканей плода, так же как продукция аутоантител, может приводить к повторным потерям беременности. В противоположность общепринятому мнению, невынашивание - прогрессирующий процесс, поскольку новые аутоантитела могут образовываться во время беременности. К счастью, эта причина невынашивания легко диагностируется, и имеется метод ее лечения.

Таблица 2

Сравнение уровня APLA у пациенток с привычным невынашиванием и без него

Таблица 3

Исходы беременности у женщин с привычным невынашиванием, получавших лечение по поводу различных ауто- и аллоиммунных патологий

Сравнительная характеристика проточной цитофлуометрии и микроцитооксичности для оценки эффективности аллоиммунной терапии у пациенток с привычным невынашиванием беременности

Am J Reprod Immunol; vol. 33, 1995; pp 10-13

W.Matzner, P.Chong, G.Xu, W.Ching

Актуальность Имеются данные об эффективности иммунизации лимфоцитами мужа в лечении иммунных форм невынашивния. Однако существуют различия между методиками определения уровня антител к отцовским лейкоцитам (APLA).

Методы исследования: 1. определение микроцитотоксичности; 2. смешанная культура лимфоцитов; 3. проточная цитофлуометрия. Результаты последних двух методик коррелировали между собой, однако цитофлуометрия показала большую чувствительность. В изучаемую группу вошли 10 женщин с тремя и более случаями самопроизвольных абортов в анамнезе. У всех 10 был очень низкий уровень APLA (менее 10%), измеренный методом проточной цитофлуометрии. После иммунизации лимфоцитами мужа у всех женщин уровень антител поднялся выше 50% (методом проточной цитофлуометрии). На 12 неделях беременности проводили измерение уровня APLA в сыворотке всеми тремя методиками.

Результаты: Хотя у всех 10 женщин методом проточной цитофлуометрии определялся высокий уровень APLA в течение беременности, только у 5 из них методом микроцитотоксичности определялись антитела к антигенам HLA класса I, а у 2 из 10 - антитела к антигенам HLA класса II. Более того, у пациенток, у которых методом микроцитотоксичности определялись антитела к отцовским антигенам HLA I типа, были обнаружены также антитела к антигенам этого класса, не встречающимся у родителей. У обеих пациенток с антителами к отцовским антигенам HLA II класса, определяемых методом смешанной культуры лимоцитов, были также положительны антитела к их собственным антигенам этой группы. Примечательно, что все 10 женщин в срок благополучно родили здоровых детей.

Заключение: по данным настоящего предварительного исследования, метод смешанной культуры лимфоцитов неодстаточно чувствителен и надежен для контроля эффективности иммунизации лимфоцитами мужа. Проточная цитофлуометрия является методикой выбора для определения необходимости аллоиммунотерапии и для контроля за ее эффективностью.

Введение

Плод является аллотрансплантатом, к которому материнский организм должен сохранять иммунологическую толерантность. Значительный интерес представляет иммунологический аспект привычного невынашивания. До 50% причин привычного невынашивания может быть вызвано нарушением продукции материнским организмом антител к отцовским антигенам (эти антитела защищают плод от атаки материнской иммунной системы) или присутствии аутоантител - антифосфолипидных и антинуклеарных. Знание патогенеза является основой терапии путем иммунизации лимфоцитами мужа, эффективность которой составляет 70-89%.

Результаты исследований зависят от выбора методики определения уровня APLA. Наиболее популярны следующие методики: 1. определение микроцитотоксичности; 2. смешанная культура лимфоцитов; 3. проточная цитофлуометрия. Результаты анализов по разным методикам отличаются: метод микроцитотоксичности определяет только антитела, фиксирующие комплемент, а проточная цитофлуометрия - как комплемент-связывающие, так и не связывающие антитела. Результаты проточной цитофлуометрии коррелировали с результатами более сложной методики смешанной культуры лимфоцитов, хотя первая методика оказалась более чувствительной. В настоящем исследовании сравнивали диагностическую и прогностическую ценность микроцитотоксичности и проточной цитофлуометрии.

Материалы и методы исследования

Изучаемая группа состояла из 10 женщин с тремя и более самопроизвольными выкидышами в анамнезе. У всех 10 был измерен низкий уровень APLA методом проточной цитофлуометрии, а методом микроцитотоксичности - отрицательный. После иммунизации лимфоцитами мужа у всех отметилось повышение уровня APLA (методом проточной цитофлуометрии) более 50%.

Материнские антитела против отцовских лейкоцитов

Антитела против лимфоцитов мужа определяли до зачатия и далее с интервалом 1 мес в течение 24 недель беременности, используя стандартную методику проточной цитофлуометрии. Положительной считалась продукция антител, если они покрывали 30% и более Т-и В-лимфоцитов мужа.

Антитела микроцитотоксичности

Антитела микроцитотоксичности определялись перед зачатием и в 12 недель гестации. 1 часть сыворотки пациентки инкубировали в течение 30 мин при 25 градусах в спец. плашке Lambda Cell Trays, добавляли 5 частей комплемента и снова инкубировали в течение 60 мин при 25 градусах; затем добавляли 1 часть фиксирующего раствора Stain-Fix и анализировали антитела микроцитотоксичности против антигенов HLA.

Иммунизация лимфоцитами мужа

Кровь мужа брали, добавляли буферный раствор Ficoll-Hypaque и центрифугировали. Мононуклеарные лейкоциты отделяли и обрабатывали раствором хлорида аммония для лизиса оставшихся эритроцитов. Тромбоциты вымывали (троекратно) с помощью солевого раствора Hank’s Balance. 40 миллионов клеток вводили внутрикожно в шесть точек предплечья. Через 4 недели иммунизацию повторяли. Через месяц после второй иммунизации осуществляли цитофлуометрический анализ для оценки ответа материнского организма. Если ответ был ниже ожидаемого, вводили еще 80 млн отцовских клеток. Пары были предупреждены о возможности отмены контрацепции только при положительном уровне антител. При необходимости иммунизацию повторяли в середине второго триместра.

Результаты

Перед началом терапии у всех 10 пациенток уровень APLA был отрицательным - и методом микроцитотоксичности и методом проточной цитофлуометрии. После иммунизации лимфоцитами мужа методом проточной цитофлуометрии зафиксировано повышение уровня антител более 50%. В 12 недель снова проводили одновременное определение уровня APLA обоими методами. Нсмотря на то, что у всех 10 пациенток в течение беременности методом проточной цитофлуометрии определялись очень высокие уровни APLA к В- и Т-лимфоцитам мужа, только у 5 из 10 методом микроцитотоксичности обнаруживались антитела к антигенам HLA класса I и только у 2 из 10 - к антигенам HLA класса II (табл. 1). Разница в спектре антител к отцовским HLA-антигенам достаточно значительна - у некоторых женщин обнаружились антитела только к двум антигенам, а у некоторых - к семи. У всех пациенток с антителами к антигенам I класса HLA отца также обнаруживались антитела к антигенам этого класса, отсутствующим у обоих родителей. У 4 из 5 обнаружились антитела к отцовским антигенам HLA и отсутствовали - к материнским, у пятой были антитела как к антигенам мужа так и к своим собственным. У обеих пациенток с антителами к антигенам HLA II класса, обнаруживаемыми методом микроцитотоксичности, присутствовали также антитела к собственным антигенам II класса. Примечательно, что все 10 женщин благополучно родили в срок здоровых детей.

Заключение

На первый взгляд, имеются значительные различия между результатами уровня антител, определяемых методами микроцитотоксичности и проточной цитофлуометрии. В то время как у всех женщин обнаружились блокирующие антитела методом цитофлуометрии, только у некотороых они найдены методом определения микроцитотоксичности. Еще более неудобна неспецифичность антител, определяемых методом микроцитотоксичности.

Эти результаты однако неудивительны. Другие исследования показали, что большинство антител, обнаруживаемых в плаценте, являются комплемент-несвязывающими. При использовании модели иммунизации лимфоцитами мужа, McLeod et al отметили появление нецитотоксических антител у пациентов после трансфузий, которые (антитела) реагировали с Fc-рецепторами В-лимфоцитов. Если теория о том, что APLA действительно блокируют иммунный ответ материнского организма, верна, необходим более чувствительный метод, поскольку эти антитела не фиксируют комплемент. Это может объяснить, почему некоторые исследователи не выявили корреляции между уровнем антител, определяемых методом микроцитотоксичности, и исходом беременности. Преимущества использования проточной цитофлуометрии по сравнению с микроцитотоксичностью в определении APLA заключаются в большей чувствительности первой методики, позволяющей определять антитела, не фиксирующие комплемент.

Основываясь на данных этого предварительного исследования, можно утверждать что метод миткроцитотоксичности недостаточно чувствителен и не подходит для определения необходимости и эффективности иммунизации лимфоцитами мужа. Диагноситческим методом выбора в данном случае является проточная цитофлурометрия.

Корреляция между уровнем антител к бета-2-гликопротеиду и уровнем антифосфолипидных антител у пациенток с невынашиванием

P.Chong, W.Matzner, W.Ching

AJRI, 1998

Резюме

Актуальность: антифосфолипидные антитела имеют значение в патогенезе невынашивания беременности. Исследования показали, что для определения АФА необходимо присутствие связывающих белков. Один из этих белков, бета-2-ГП, необходим для определение антител к кардиолипину. Создается впечатление, что некоторые АФА могут быть направлены против связывающих белков или против их комбинаций с фосфолипидами.

Методы исследования: сравнивали уровни антифосфолипидных антител с уровнями антител к бета-2-ГП в сыворотках 123 женщин моложе 40 лет с привычным невынашиванием в анамнезе. Измеряли уровни антител к шести фосфолипидным антигенам: кардиолипину, фосфатидилэтаноламину, фосфатидилсерину, фосфатидилинозитолу, фосфорной кислоте и фосфатидилглицерину.

Результаты: у 33 из 123 обследованных женщин выявились IgG-антитела к одному или более фосфолипидам, у 9 из 33 - к кардиолипину. Только у 1 из 123 женщин обнаружились IgG-антитела к бета-2-ГП, при этом АФА у нее не было. У 38 из 123 определили IgM-антитела к одному или более фосфолипидам, ни у одной не обнаружен IgM к кардиолипину. IgM-антитела к бета-2-ГП имели 8 из 123, из них у 5 обнаруживались IgM-АФА, у 4 из 5 - IgM-антитела к фосфатидилэтаноламину и у 1 - к фосфатидилинозитолу.

Заключение: не выявлено корреляции между уровнями антител к бета-2-ГП и фосфолипидам в изучаемой популяции. Наиболее чувствительным методом по определению АФА насегодняшний день является ELISA.

Введение

Антитела к фосфолипидам являются важным этиологическим фактором невынашивания беременности. Первые исследования по этой проблеме изучали присутствие антител к кардиолипину, нарушающих процесс имплантации у женщин с СКВ. Иммуннологическое невынашивание связано с тромбозами, антитела к кардиолипину могут повреждать мембрану тромбоцитов и эндотелиоцитов, нарушать активацию протеина С (естественного антикоагулянта) и ингибировать простациклин. Кардиолипин обнаруживается во внутренней мембране митохондрий, в отличие от других фосфолипидов, присутствующих в поверхностной клеточной мембране. У пациенток с привычным невынашиванием и неудачными попытками ЭКО большинство АФА направлено против некардиолипиновых антигенов (более 90%).

Антитела к различным фосфолипидам лучше всего определяются методом ферментсвязывающего иммуносорбентного анализа ELISA; фосфолипиды наносят на полистиреновую плашку, антитела определяют по интенсивности связывания с фосфолипидами, которую измеряют при помощи колориметрии. Для определения АФА необходимо присутствие связывающих протеинов; в сыворотке плодов и новорожденных методом ELISA АФА не обнаруживаются. Бета-2-ГП - специфический протеин, способствующий связыванию кадиолипиновых антител с кардиолипином. Предполагаемые механизмы: 1. Антикардиолипиновые антитела распознают комплекс кардиолипина с бета-2-ГП; 2. Бета-2-ГП, а не кардиолипин является мишенью для антител; 3. Антигеном является структурная часть бета-2-ГП. Зависимость определения антител от присутствия бета-2-ГП может быть связана с конкретным заболеванием. В одном исследовании было показано присутствие антикардиолипиновых анттел и антител к компоненту бета-2-ГП у женщин с СКВ. В другом исследовании такая взаимосвязь была подтверждена, за исключением пациентов с терминальной стадией почечной недостаточности.

Нередко встречаются ложноположительные результаты антикардиолипиновых антител - например, при сифилисе. Данные проведенных исследований достаточно противоречивы. Так отмечена корреляция между свойствами антикардиолипиновых антител как волчаночного антикоагулянта и наличием бета-2-ГП; с другой стороны показано отсутствие корреляции между бета-2-ГП и уровнем антикардиолипиновых антител при СКВ. Отмечена корреляция между предшествующими тромбозами и присутствием бета-2-ГП, но не между невынашиванием и бета-2-ГП. Пациенты с АФА представляют собой гетерогенную группу с антителами, направленными против фосфолипидов и/или против белка, связывающего фосфолипиды.

Мы определяли корреляцию между уровнем антител к фосфолипидам и к бета-2-ГП у пациенток с неудачными попытками ЭКО.

Методы исследования

Изучаемый контингент

Обследовано 123 пациентки в возрасте моложе 40 лет с полсле нескольких неудачных попыток ЭКО. Мужской фактор был исключен, трмбоэмболических нарушений в анамнезе не было, как и самопроизвольных абортов.

Определение АФА и бета-2-ГП методом ELISA

В сыворотке пациенток определяли присутствие антител двух изотипов (IgG, IgM) к шести различным фосфолипидам (кардиолипин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин и фосфорная кислота). Пограничным значением для положительного анализа считали превышение 2 стандартных отклонений по сравнению со средним значением, положительный результат - более трех стандартных отклонений. Также сыворотку всех пациенток тестировали на присутствие антител к бета-2-ГП методом ELISA. В контрольную группу вошло 40 фертильных женщин, не имеющих в анамнезе ни невынашивания, ни аутоиммунных состояний.

Результаты

У 33 женщин из 123 обследованных были положительны IgG-антитела к одному или нескольким фосфолипидам; из этих 33 у 9 - к кардиолипину. Только у 1 из 123 обследованных обнаружились IgG-антитела к бета-2-ГП, при этом АФА у нее не было. У 38 из 123 женщин обнаружились IgM-антитела к одному или нескольким фосфолипидам, ни у одной - против кардиолипина. У 8 из 123 обнаружились IgM-антитела к бета-2-ГП, из них у 5 одновременно присутствовали IgM-антитела к фосфолипидам, из них у 4 - к фосфатидилэтаноламину и у 1 - к фосфатидилинозитолу (рис.1)

Обсуждение

Наше исследование выявило отсутствие корреляции между АФА и антителами к бета-2-ГП. Частота обнаружения антител к бета-2-ГП составила около 7% (9 из 123), при этом у 4 одновременно выявлялись IgM к фосфатидилэтаноламину, у 1 - к фосфатидилинозитолу и у 4 только антитела к бета-2-ГП (1 IgG и 3 IgM), без АФА.

В предыдущих исследованиях частота обнаружения АФА у пациенток с привычным невынашиванием фиксировалась более чем в 50%, при этом антикардиолипиновых антител - только в 6%. Настоящее исследование показало, что только у 7% из 123 пациенток присутствовали антитела к кардиолипину.

В отличие от других исследователей, мы не смогли выявить корреляции между антителами к кардиолипину и к бета-2-ГП.

Нам известно, что антикардиолипиновые антитела взаимосвязаны со специфическими аутоиммунными состояниями, такими как СКВ, а также с тромбоэмболическими явлениями, включая периферические тромбозы и невынашивание беременности. Механизм действия предполагается следующий - повышение коагуляционного потенциала путем блокирования активности протеина С, простациклина, повреждения мембраны тромбоцитов и эндотелия. Бета-2-ГП может быть эпитопом, с которым связываются антикардиолипиновые антитела. Активность волчаночного антикоагулянта, связанная с этими антителами, также может зависеть от бета-2-ГП.

Способности фосфолипидов к адгезии может играть важную роль в иммунологии репродукции, АФА могут нарушать адгезию фосфолипидов, что может приводить к невынашиванию. Sessions et Horowitz продемонстрировали значение фоссфолипидов в формировании синцития в культуре миобластов, а Leyden et Rote показали, что фосфолипиды необходимы для превращения цитотрофобласта в синцитиотрофобласт, а также что антитела к фосфолипидам нарушают этот процесс формирования синцитиотрофобласта.

Настоящее исследование вновь показало, что женщины с повторными неудачными попытками ЭКО в анамнезе часто имеют повышенный уровень АФА, при этом встречаемость антикардиолипиновых антител достаточно низка. Не выявлено корреляции между антителами к бета-2-ГП и АФА в данной популяции. Т.о. определениеп уровня антитела к бета-2-ГП не имеет диагностического значения при аутоиммунной природе невынашивания после ЭКО.

АНТИТЕЛА К ФОСФАТИДИЛЭТАНОЛАМИНУ И ФОСФАТИДИЛСЕРИНУ СВЯЗАНЫ С ПОВЫШЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ ЕСТЕСТВЕННЫХ КИЛЛЕРОВ У ПАЦИЕНТОК С БЕСПЛОДИЕМ И ИСКЛЮЧЕННЫМ МУЖСКИМ ФАКТОРОМ

G.Sher, J.Fisch, G.Maassarani et al.

Human Reprod; vol. 15, № 9, pp 1932-1936; 2000.

АФА были выявлены у пациенток с привычным невынашиванием беременности и неудачными попытками ЭКО. Из них специфическое значение имеют антитела к фосфатидилэтаноламину и фосфатидилсерину (АТ ФЭА/ФС). Также отмечена связь между повышенной активностью естественных киллеров (ЕК) и апоптозом клеток трофобласта. Целью настоящего исследования было определить взаимосвязь спектра АФА с активностью ЕК периферической крови. Мы измерили уровень АФА и активность ЕК у 197 женщин, кандидаток на ЭКО. У 80 пациенток (45%) были обнаружены АФА, из них у 51 (57%) - АТ ФЭА/ФС. У 54 пациенток (27%) отмечена повышенная активность ЕК. У 51% женщин с положительным результатом на АФА и у 78% пациенток с АТ ФЭА/ФС была повышена активность ЕК (при отрицательных результатах на АФА и АТ ФЭА/ФС - у 8 и 13%, соответственно; р < 0,0001). У пациенток с исключенным мужским фактором бесплодия отмечались АФА и повышенная активность ЕК в 57 и 34% случаев, соответственно, по сравнению с 19 и 13% при мужском факторе. У 88% женщин с АТ ФЭА/ФС и отсутствием мужского фактора, была повышена активность ЕК, по сравнению с 12% в отсутствие АТ ФЭА/ФС (р<0,0001) и 25% при АТ ФЭА/АФС и мужским фактором (р<0,0001). Эти находки выявляют прямую зависимость между уровнем АФА (особенно АТ ФЭА/АФС) и повышением активности периферических ЕК у женщин с отсутствием мужского фактора бесплодия. Возможно, что АФА напрямую не вызывают невынашивания, но играют роль маркеров и посредников в патологической активации клеточного иммунитета.

Введение

Многочисленные исследования показали повышенный уровень АФА у женщин с бесплодием. Однако точная взаимосвязь между уровнем АФА и бесплодием, в частности, при неудачах ЭКО, остается загадкой (Coulam, 99). В некоторых исследованиях предположено влияние избытка АФА на исход ЭКО (Birkenfeld et al, 94; Geva et al, 94; Sher at al, 94; Dmowski et al, 95), а в некоторых других такой взаимосвязи не выявлено (Gleicher et al, 94; Birdsall et al, 96; Denis et al, 97, Kowalick et al, 97; Kutteh, 97). Возможными объяснениями для таких различных выводов могут быть: 1. Отсутствие стандартизации в измерениях уровня АФА; 2. Различные нормативы определения положительных и отрицательных результатов; 3. Различия между изучаемыми группами пациенток; 4. Процедура ЭКО, по своей сути, включает столько сложных и чувствительных этапов, что невозможно избежать влияния каждого фактора на исход всей процедуры.

Авторы ранее отмечали корреляцию между положительным уровнем АФА и уменьшением эффективности ЭКО в случаях органического женского бесплодия и бесплодия неясного генеза (Sher et al, 94). Эффективность ЭКО у таких пациенток значительно повышается при введении низких доз антикоагулянтов (гепарин/аспирин) (Sher et al, 94). Однако мы заметили, что в отличие от других АФА, в присутствии IgG или IgM АТ ФЭА/ФС изолированная антикоагулянтная терапия не оказывается успешной (Sher et al, 98). У таких пациенток эмпирическое добавление внутривенного иммуноглобулина (ВВИГ) улучшает исход ЭКО (Sher et al, 98). Терапевтическое значение ВВИГ в лечении невынашивания противоречиво (Balasch et al, 96; Christiansen, 98; Daya et al, 98; Stephenson et al, 98). Однако сторонники его использования при иммунном невынашивании и неудачах ЭКО предполагают, что механизм действия может опосредоваться подавлением цитотоксической активности и смещением клеточного равновесия в сторону Th2-звена, дружественного по отношению к трофобласту (De Placido et al, 94).

Настоящее исследование имеет две цели. Первая - оценить уровень АФА и активность ЕК у пациенток-кандидатов на ЭКО, имеющим органические причины бесплодия (эндометриоз, перитонеальные спайки) или бесплодие неясного генеза, по сравнению с группой пациенток с изолированным мужским фактором бесплодия. Вторая - представить наш успешный опыт применения в программе ЭКО ВВИГ у пациенток с ТА ФЭА/ФС, приводивший к снижению уровня этих антител и подавлению активности ЕК. Мы попытались оценить взаимосвязь между наличием антител против этих специфических фосфолипидов и повышением активности периферических ЕК.

Пациенты и методы исследования

Исследования проводились в интервале между декабрем 98 и июнем 99гг. Возраст пациенток - моложе 40 лет; пациентки готовились к процедуре ЭКО; уровень ФСГ на 3 день цикла - менее 10 мМЕ/мл. Всем пациенткам проводили скрининг на иммунологические отклонения - как обязательную часть обследования. Показаниями к ЭКО служили: мужской фактор бесплодия, эндометриоз, тазовые спайки и бесплодие неясного генеза при неэффективности предшествующего лечения. Сочетание мужского и женского факторов расценивалось как женский фактор. Среди пациенток с эндометриозом преобладали 1 и 2 степени.

Пациенткам с бесплодием неясного генеза проведена лапароскопия для исключения непроходимости труб и эндометриоза, также проверяли состояние полости матки и эндометрия путем гистероскопии и гистеросальпингографии. У них присутствовала овуляция, не было обнаружено патологии спермы или наличия антиспермальных антител.

Лабораторные исследования

Пациенткам определяли наличие антиспермальных антител методом ELISA: IgM, IgG, IgA-изотипы к шести фосфолипидам (кардиолипин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфорная кислота, фосфатидилглицерин, фосфатидилинозитол). Контрольная группа для определения АФА включала 40 фертильных женщин в возрасте 25-45 лет, без признаков аутоиммунных нарушений (клинических или субклинических) в анамнезе, а также повторных невынашиваний. Пограничное положительное значение анализа определялось при повышении средних цифр контрольной группы на 2 стандартных отклонения; положительное значение - на 3 отклонения.

Оценку функции ЕК осуществляли с помощью цитофлуометрии. К-562-клетки выращивали в стационарной культуре в присутствии 5% СО2 при 37 градусах в течение 3 дней. Непосредственно перед исследованием клетки инкубировали в растворе диоктадецилоксакарбоцианина перхлората (DiO) 30 ммоль/л в течение 20 минут при 37 градусах в присутствии 5% СО2. Эффекторные клетки отделяли от гепаринизированной крови центрифугированием с FicolHypaque. Клетки-мишени в стандартных концентрациях и эффекторные клетки в различных разведениях (1:1, 1:2, 1:4, 1:8) добавляли для создания отношения эффекторов к клеткам-мишеням от 50:1 до 6,25:1. 130 мкл пропидиума йодида добавляли в пробирку, и смесь центрифугировали в течение 30 с на 1000 оборотах для разделения клеток-мишеней, эффекторных клеток и пропидиума йодида. Затем к образцу добавляли либо интерлейкин-2 (ИЛ-2), либо различные концентрации ВВИГ, далее образец инкубировали в течение ночи при 37 градусах в присутствии 5% СО2. В каждом образце дифференцировали спонтанный лизис от истинного. На основании исследования популяционных данных, повышенной считалась активность ЕК более 10%, киллерная активность повышалась в присутствии ИЛ-2 и снижадлась минимум на 50% после введения ВВИГ.

Статистическая обработка - методы Фишера и хи-квадрат, статистически значимым считалось значение р < 0,05.

Результаты

В течение изучаемого периода у 197 пациенток определяли присутствие АФА и активность ЕК. У 89 пациенток (45%) присутствовали АФА, у 51 из них (57%) были положительны IgG или IgM против ФЭА/ФС (табл. 1 и 2). У 54 женщин (27%) отмечена повышенная активность ЕК (табл. 2). Средний возраст пациенток составил 35,7 лет. Изолированный мужской фактор присутствовал у 63 женщин (32%), эндометриоз - у 54 (27%), тазовые спайки- у 55 (28%), бесплодие неясного генеза - у 25 (13%) (табл.1). У 65% женщин (35 из 54) с эндометриозом АФА были положительны, у 44% (24 из 54) - также повышена активность ЕК (табл. 1). Среди женщин с тазовыми спайками и бесплодием неясного генеза, у 56% (31 из 55) и у 44% (11 из 25), соответственно, были положительны АФА; и у 27% (15 из 55) и 28% (7 из 25), соответственно, - повышена активность ЕК (табл. 1). При эндометриозе повышенная активность ЕК встречалась как минимум в два раза чаще, чем при других диагнозах. У 45 из 89 женщин (51%) с положительными АФА и у 40 из 51 (78%) с положительными АТ ФЭА/ФС была повышена активность ЕК (ср. у 9 из 10-8 (8%) и у 5 из 38 (13%) с отрицательными АФА и отрицательными АТ ФЭА/ФС, соответственно; р < 0,0001; табл. 2)).

У 57% (77 из 134) пациенток с органическим женским фактором бесплодия или бесплодием неясного генеза АФА были положительны, в то время как только 19% (12 из 63) пациенток с изолированным мужским фактором имели положительные АФА (р < 0,004. Табл. 1). Кроме того, 85% (46 из 54) пациенток с повышенной активностью ЕК имели органические причины женского бесплодия по сравнению с 15% (8 из 54) с изолированным мужским фактором (р < 0,002. Табл. 2). У 88% (38 из 43) пациенток с женским фактором бесплодия и положительными АТ ФЭА/ФС была повышена активность ЕК по сравнению с только 12% (4 из 34) женщин с отрицательными АТ ФЭА/ФС (р<0,0001, табл. 2) и 25% (2 из 8) женщин с АТ ФЭА/ФС и изолированным мужским фактором, соответственно (р < 0,0001, табл. 2)

Таблица 1

Группы пациенток и встречаемость АФА и повышенной активности ЕК

* р < 0,004 по ср. с пациентками с мужским фактором бесплодия и положительными АФА

Таблица 2

Взаимосвязь АФА, АТ ФЭА/ФС с повышенной активностью ЕК у пациенток с мужским и женским факторами бесплодия

*p<0,0001 по ср. с АФА-, нормальной активностью ЕК

** p<0,0001 по ср. с АТ ФЭА/ФС-, нормальной активностью ЕК

*** p<0,0001 по ср. с АФА+, мужским фактором бесплодия

**** p<0,002 по ср. с повышенной активностью ЕК и мужским фактором бесплодия

***** p<0,0001 по ср. с АТ ФЭА/ФС-, женским фактором бесплодия

****** p<0,0001 по ср. с АТ ФЭА/ФС+, мужским фактором бесплодия

( ) - женщины с антитиреоидными антителами

[ ] - пары с совпадением по HLA DQ-a

Обсуждение

АФА обнаруживаются в общей популяции с частотой 5-17% (Matzner et al, 94). Хорошо известно, что АФА чаще встречаются при привычном невынашивании (Rote, 96; Sugi et al, 99), заболеваниях органов малого таза, таких как эндометриоз (Gleicher et al, 87), хронический сальпингоофорит и спаечный процесс (Sher et al, 94); бесплодии неясного генеза (Roussev et al, 96), повторных неудачных попытках ЭКО (Fisch et al, 91). В случаях органических заболеваний органов таза частота встречаемости АФА составляет около 50%, в то время как при изолированном мужском факторе бесплодия частота встречаемости АФА приблизительно равна 15% (как в общей популяции) и не влияла на исход ЭКО (Sher et al, 94). Ранее иммунологические причины невынашивания сводились к влиянию АФА, особенно направленных против кардиолипина, и волчаночного антикоагулянта.

Образование АФА против каких-либо специфических эпитопов зависит от частоты их встречаемости в изучаемой группе клеток. Антитела к поверхностным фосфолипидам клеточных мембран (например, ФЭА и ФС) встречаются чаще, и когда присутствуют только они, как правило, не встречается системных заболеваний, но могут наблюдаться легкие иммунологические отклонения, нарушающие процессы имплантации и ранней гестации. Кардиолипин, напротив, как правило, расположен внутриклеточно, на внутренней мембране митохондрий (Hatch, 98). Соответственно, образование антител к кардиолипину ожидается при тяжелых клеточных повреждениях (в отличие от АТ к ФЭА/ФС, расположенным на поверхности клеток, образующихся при незначительных повреждениях), что может объяснить более частое обнаружение АТ к кардиолипину при тяжелых клинических состояниях, связанных с антифосфолипидным синдромом.

Определение волчаночного антикоагулянта - другой частый тест активности АФА. Однако волчаночный антикоагулянт - это совокупность многих АФА, и из-за низкой чувствительности и специфичности его клиническая польза ограничена только диагностикой таких системных аутоиммунных заболеваний, как, например, СКВ.

Мы обследовали женщин на АФА с использованием панели шести фосфолипидов - для каждого с изотипами IgG, IgM, IgA. Ранее мы отмечали, что в присутствии АФА лечение гепарином и аспирином в два раза повышало частоту наступления беременности при ЭКО у пациенток с органическим женским фактором бесплодия (Sher et al, 94). Однако у пациенток, которые не смогли забеременеть в течение первого цикла лечения и которым проводили повторную процедуру ЭКО, дальнейшее лечение гепарином и аспирином уже не улучшало результат (Sher et al, 98). Если у таких женщин обнаруживались антитела класса IgG и/или IgM против ФЭА/ФС, эмпирическое введение ВВИГ значительно повышало процент вынашивания (Sher et al, 94). Такое резкое улучшение эффекта от ВВИГ мы не наблюдали при наличии других видов АФА. ВВИГ неизбирательно предупреждает связывание антител. Он также является иммуномодулятором, подавляющим активность активированных ЕК (Finberg et al, 92; Kwak et al, 96). Присутствие АТ ФЭА/ФС у женщин с бесплодием сочетается с повышением активности ЕК и снижением эффективности ЭКО, в то время как при изолированном мужском факторе бесплодия эти антитела не оказывали влияния на исход ЭКО и не сочетались с повышенной активностью ЕК. Этот факт может оспорить гипотезу о прямой взаимосвязи между присутствием АФА и нарушениями репродукции. Скорее стоит говорить о том, что у некоторых пациенток АТ ФЭА/ФС являются маркерами или посредниками происходящих клеточных взаимодействий, которые проявляются в частности повышением активности ЕК.

ЕК - это крупные гранулярные лимфоциты, образующиеся в костном мозге и циркулирующие в периферической крови до выхода в специфические ткани. Эта популяция лимфоцитов преобладает в секреторном эндометрии и децидуальной оболочке на ранних сроках беременности (Starkey et al, 98). Считается, что они регулируют инвазию трофобласта. Повышенная активность ЕК в периферической крови может быть отражением повышения их активности в эндометрии. Оба этих процесса зарегистрированы у женщин с привычным невынашиванием и неудачами ЭКО (Fukui et al, 99).

Классические ЕК эндометрия имеют фенотип CD56+/16-, могут быть легко активированы кратковременным воздействием цитокинов, таких как ИЛ-2, и становятся лимфоцит-активированными киллерами (LAK) (King et al, 96). LAK экспрессируют маркер CD16+ и содержат гранулы цитокинов группы Th1, таких как TNFa , Ifg (Faust et al, 99). Выделение Th1-цитокинов связано с усилением апоптоза клеток трофобласта и децидуа, возможно путем нарушения соотношения bcl-2:bax (Lea et al, 99). Повышенное абсолютное количество CD56+клеток также зафиксировано в эндометрии женщин с привычным ранним невынашиванием (Clifford et al, 99; Fukui et al, 99).

Мы обнаружили повышение активности ЕК у 44% женщин с эндометриозом. Это противоречит более ранним находкам о снижении активности ЕК в перитонеальной жидкости и периферической крови у женщин с эндометриозом (Oosterlink et al, 92; Ho et al, 97). Такие различия могут частично объясняться раницей обследованных контингентов. В нашем исследовании принимали участие женщины с ранними стадиями заболевания, без предшествующего лечения. Кроме того, для определения актвности ЕК мы использовали метод проточной цитофлуометрии, в предыдущих же исследованиях авторы использовали измерение экскреции Cr51.

Иммунологические аспекты репродуктивного здоровья - сложная загадка. Однако роль иммунных факторов неоспорима. Результаты настоящего исследования подтвердили наши предшествующие предположения о том, что изолированный мужской фактор не связан с иммунологическим бесплодием (Sher et al, 94). Мы показали, что АФА (а именно IgG и/или IgM АТ ФЭА/ФС) ассоциированы с повышеннием цитотоксичности периферических ЕК у женщин с отсутствием мужского фактора бесплодия. Это позволяет предположить, что АФА скорее не напрямую влияют на процессы зачатия и вынашивания, а являются маркерами или посредниками имеющихся отклонений клеточного иммунитета. С этой позиции мы убеждены в наличии взаимосвязи между уровнем АФА и повышеной активностью ЕК. Известно, что ЕК играют значительную роль в процессах имплантации. Будущие исследования должны фокусироваться на следующих моментах: имеется ли прямое влияние АФА на продукцию Th1-цитокинов; коррелирует ли активность ЕК в периферической крови с их активностью в эндометрии; может ли подавление активности ЕК улучшить результаты ЭКО.