Молекулярные основы действия агонистов и антагонистов стероидных рецепторов

D.P.McDonnell, B.L.Wagner

(перевод Малярской М.М.)

Введение

Биологическое действие эстрогенов и прогестерона на органы- мишени, такие как матка, молочные железы и ЦНС, хорошо известно (1). Однако обнаружение рецепторов к эстрогенам (Эр) и прогестерону (Пр) в тканях, не являющихся классическими мишенями, свидетельствует о том, что стероидные гормоны регулируют не только репродуктивные процессы. В частности, показано защитное влияние эстрогенов на костную ткань, препятствующее развитию остеопороза у женщин в постменопаузе (2). Заместительная гормональная терапия эстрогенами (ЗГТ), помимо влияния на кости, снижает риск развития сердечно-сосудистых расстройств, обычно повышающийся после менопаузы (3). В настоящее время неизвестно, каким образом половые стероидные гормоны реализуют свое действие в этих системах организма. Повышенный интерес к изучению молекулярных и генетических основ строения Эр и Пр связан с разработкой новых модуляторов этих рецепторов, которые предполагается использовать при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, остеопороза (ОП), а также репродуктивных нарушений и гормонозависимого рака.

Рецепторы к эстрогенам и прогестерону и их генетический контроль

Биологическое действие эстрогенов и прогестерона реализуется через высокоаффинные ядерные рецепторы в клетках-мишенях. Альфа-эстрогеновый рецептор (Эр) представляет собой простой белок с молекулярной массой 25 кД (4). Недавно была открыта бета-форма Эр, представленость этих форм в тканях-мишенях различается (глава 11). Существующие различия между подтипами Эр, заключающиеся в выраженности аффинитета к лигандам и распределении в тканях, могут объяснять селективное действие агонистов и антагонистов Эр в различных тканях. Открыты и разновидности мРНК, потенциально кодирующие синтез других подтипов Эр, однако биологическая значимость этих возможных подтипов пока не изучена (5). Пр также существуют в виде двух различных форм - Пр-А и Пр-В, 94 и 114 кД, соответственно (6). Обе формы кодируются одним геном, путем альтернативной инициации транскрипции с разных промоторов (7).

Изучаемые рецепторы относятся к большому семейству ядерных белков, опосредующих биологическое действие стероидных гормонов, гормонов щитовидной железы, витаминов Д и А (8). Анализ нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей синтез этих рецепторов, а также изучение биологической активности изоформ рецепторных белков, полученных в результате мутаций гена, показали их сходную структуру (8, 10). Домен, связывающий лиганд, находится на карбоксильном конце полипептидной цепи и состоит из 300 аминокислот, а домен, связывающий ДНК, состоит из 66-68 аминокислот. Этот домен, находящийся на NH2-конце белка, наиболее вариабелен по строению, и именно он вовлечен в регуляцию транскрипции (7, 11-15). Предполагается, что последовательность, активирующая этот домен (TAF), для Эр и Пр-А находится в одном месте, а для Пр-В существует дополнительная последовательность (BUS) (17, 18).

Регуляция транскрипции эстрогеновыми и прогестероновыми рецепторами

Общий механизм рействия рецепторов к стероидным гормонам сходен (19, 20). В отсутствие гормонов рецепторы находятся в ядре клеток-мишеней в латентной форме, связанные с высокомолекулярным белком теплового шока 90 (hsp90), hsp 72, hsp 59 и возможно другими белками (21-23), рис. 12.1. Точная стехиометрия комплекса рецептор-белки теплового шока до конца не изучена, однако считается, что в состав одного олигомерного комплекса входит только одна молекула рецептора (24). Роль белков теплового шока в регуляции активности рецепторов неизвестна, они могут участвовать в поддержании рецептора в неактивном состоянии, пока нет взаимодействия с гормонами (25-27). Предполагается, что обратимое связывание со стероидным лигандом приводит к конформационным изменениям молекулы рецептора, высвобождающим его из комплекса с белками теплового шока (23). Несмотря на то, что все рецепторы к стероидным гормонам связаны с hsp 90, похоже, что роль этого белка в регуляции биологической активности разных рецепторов разная. Например, показано, что hsp 90 участвует в образовании гормон-связывающей активной формы рецептора к глюкокортикоидам (8), но не участвует в образовании активной формы связывающего домена Эр (29). Очень мало известно о роли других белков теплового щока, связанных с неактивным рецептором (21, 30).

Инициация передачи сигнала прогестероновым рецептором

Взаимодействие молекулы прогестерона с Пр инициирует каскад передачи сигнала путем отсоединения белков теплового шока (31) и образования стабильного рецепторного димера. В клетках, одновременно экспрессирующих Пр-А и Пр-В, существует 3 различных типа димеров (А:А, А:В, В:В). Относительная плотность каждого димера пропорциональна уровню экспрессии Пр-А и Пр-В (31, 32). Активированный рецепторный димер способен взаимодействовать со специфическими элементами ответа на прогестерон (PRE), расположенными в промоторе регулируемого гена (33). Помимо образования рецепторного димера, взаимодействие рецептора с гормоном повышает уровень фосфорилирования Пр (34-36). Активация фосфорилирования происходит двумя невзаимосвязанными способами: путем отделения белков теплового шока и взаимодействия рецептора с ДНК (35, 36). Специфическое значения этого фосфорилирования до сих пор неизвестно.

Инициация передачи сигнала эстрогеновым рецептором

Взаимодействие Эр со специфической последовательностью ДНК в регуляторном участке гена-мишени - конечный итог в цепи передачи сигнала. Однако роль гормонов в осуществлении этого взаимодействия противоречива (37). В то время как считалось доказанным, что гормон необходим для взаимодействия Эр с ДНК в интактных клетках (37-40), анализ Эр-ДНК взаимодействия in vitro показал отсутсвие такой необходимости (41). Дальнейшие исследования показали, что перенос гена, экспрессирующего Эр, в клетки HeLa, в отсутствие лиганда было достаточным для транскрипции регулируемого гена (42). Возможно, что этот тип лиганд-независимой активации является следствием избыточной экспрессии рецепторов.

Стероидные гормоны реализуют свой эффект путем транскрипции генов с помощью специфических внутриклеточных рецепторных белков. Изученные генетические и биохимические процессы позволяют предположить, что передача сигнала в ядро осуществляется серией последовательных шагов. Гормон заходит в клетку пассивно, находит свой рецепторв (SR) в комплексе с белками теплового шока (hsp). Связывание лиганда инициирует каскад реакций, включающих фосфорилирование, димеризацию, ядерную транслокацию, взаимодействие со специфическими элементами ответа в ДНК (SRE) и активации адапторного белка, позволяющего стероидному рецептору активно взаимодействовать с аппаратом транскрипции (GTA). Конечным итогом клеточных и ядерных взаимодействий является активирующее влияние на РНК-полимеразу и усиление трранскрипции регулируемого гена.

Эр и Пр как факторы транскрипции

В последнее время предпринимаются шаги в изучении механизма регуляции транскрипции РНК-полимеразой II (43). Транскрипция в эукариотической клетке является сложным комплексом взаимодействий между белками, связанными в специфическом участке ДНК, и промотором. Промотерные последовательности расположены в начале транскрибируемого участка (core promoter) и в обе стороны от него (enhancer). Core promoter, необходимый для начала транскрипции, состоит инициального комплекса, расположенного +1 и комплекса ТАТА, расположенного -25 (44). Эти элементы промотора при соответствующей стимуляции способствуют прикреплению РНК-полимеразы к промотору. Активированные Эр и Пр участвуют в транскрипции, связываясь с промоторными последовательностями регулируемого гена (45). Точный механизм влияния Эр и Пр на РНК-полимеразу II неизвестен. Показано in vitro потенцирование транскрипции с помощью активного Пр путем стабилизирования инициального комплекса (46). Показано взаимодействие Эр и Пр с общим фактором транскрипции (TFIIB) (47), что свидетельствует о прямом влиянии рецепторов на аппарат транскрипции. Кроме прямого влияния, гормон-активированный рецептор может влиять на транскрипцию путем медиаторных белков. Похоже, что эти белки по-разному экспрессируются в клетках-мишенях, и в связи с этим их уровень экспрессии может влиять на чувствительность клеток к гормонам; также они влияют на процесс распознавания агонистов и антагонистов рецепторов (16, 48). Недавно были выделены и клонированы медиаторные белки, селективно взаимодействующие с Эр и Пр, активированными именно агонистами (49-52).

Антагонисты рецепторов стероидных гормонов

Существует две модели действия антагонистов стероидных рецепторов. Первая - конкурентное взаимодействие, блокирующее центр связывания с эндогенными лигандами. При этом рецептор остается в неактивном, латентном состоянии (рис. 12.2.А). Вторая модель - псевдоагонизм, подражание естественным агонистам, однако после связывания с псевдоагонистом рецептор начинает подавлять транскрипцию. В результате этого взаимодействия "неактивный" рецептор (рис. 12.2В) может конкурировать с активированным агонистом рецептором за связывание с ДНК. Фармакологические влияния двух типов антагонистов различаются (53). Вторая модель лучше объясняет механизм действия большинства известных антагонистов стероидных рецепторов.

В отсутствие гормона рецептор находится в неактивном состоянии в ядре клетки-мишени. Гормон свзяывается с рецептором, это инициирует каскад реакций, приводящих в конечном итоге к изменению скорости транскрипции регулируемого гена. Существует как минимум два типа антагонистов стероидных рецепторов. Первый класс конкурентно взаимодействует с рецептором и блокирует действие агонистов. Этот пассивный тип ингибирования удерживает рецептор в латентном состоянии в то время как антагонист физически связан с ним. Альтернативой служит второй, активный тип ингибирования. Такие антагонисты действуют как псевдоагонисты, подражая некоторым их эффектам. Такие антагонисты переводят Пр из латентной формы в т.н. неактивную, которая обладает дополнительной ингибиторной активностью, конкурируя с активной формой, связанной с гормоном, за связывание с промоторными участками ДНК, и блокируя аппарат транскрипции. Все кроме одного существующие сегодня антигормоны относятся к активным ингибиторам или псевдоагонистам.

Антагонисты прогестероновых рецепторов

Существующие антипрогестины прямо взаимодействуют с гормон-связывающим доменом Пр, конкурентно блокируя связывание прогестерона. Кроме одного исключения (ZK98299; Onapristone), взаимодействие рецептора с антигормонами достаточно для его связывания с регулируемой последовательностью ДНК (54, 55). Механизм действия ZK98299 отличается тем, что он связывается с рецептором, но не приводит к образованию высокоаффинного комплекса Пр-ДНК in vitro. Одно из возможных объяснений - ZK98299 предотвращает димеризацию рецептора, необходимый шаг для связывания ДНК. Т.о. антипрогестины можно разделить на два типа: тип 1 - предотвращающие связывание с ДНК (онапристон) и тип 2 - способствующие связыванию (Рис. 12.3). В отличие от онапристона (тип 1), антипрогестины 2 типа проявляют частичную активность агонистов в соответствующих условиях. Однако в последнее время появляются доказательства того, что различия между типами антипрогестинов касаются не столько строения, сколько аффинитета. Это соответствует данным лаборатории Milgrom, сотрудники которой показали, что in vivo онапристон в насыщающей концентрации оказывает действие идентичное антипрогестинам 2 класса (58). Однако на сегодняшний день сохраняется классификация антипрогестинов в зависимости от того, предотвращают (тип 1) или активируют они взаимодействие рецептора с ДНК in vitro (с использованием номенклатуры Klein-Hipass, 54).

Хотя и агонисты и антагонисты взаимодействуют с лиганд-связывающим доменом, было показано с помощью мутагенеза рецепторов, что связывающие последовательности для агонистов и антагонистов хоть и перекрываются, но все-таки различны (59, 60). Идентицифицирован мутантный Пр (Пр-Up-1), в котором отсутствует 54-я с СООН-конца аминокислота; с этим мутантным рецептором могут связываться антагонисты и не могут агонисты. Более того, при связывании с этим рецептором антипрогестин Ру486 проявляет себя как агонист. В серии экспериментов Benhamou et al идентифицировали аминокислоты в лиганд-связывающем домене Пр, изменение которых нарушало связывание антагонистов, но не агонистов (59). Эти данные демонстрируют, что последовательности, необходимые для связывания прогестерона и Ру486 различны. Второй вывод заключается в том, что карбоксильный конец Пр может быть частью функционального комплекса, который в отсутствие гормона поддерживает рецептор в неактивном состоянии. Мы продолжили эти исследования и продемонстрировали, что существует третий класс лигандов, т.н. смешанные агонисты, взаимодействующие с лиганд-связывающим доменом по механизму, отличающемуся и от агонистов и от антагонистов (61). Т.о. мы пришли к выводу о том, что биологическое действие лиганда Пр зависит от механизма его взаимодействия с рецептором (48, 60, 62).

Важным ключом к пониманию того, каким образом в клетке происходит различение лигандов Пр, являются результаты исследования Allan et al (62). Авторы, изучая строение синтезированного in vitro Пр при помощи частичного протеолиза продемонстрировали, что прогестерон и Ру486 вызывают различные конформационные изменения рецепторного белка. Используя специфические моноклональные антитела, исследователи показали, что конформационные изменения происходят в карбоксильном конце рецептора (60, 62). Wagner et al, продолжая подобные эксперименты, показали, что смешанные агонисты Пр вызывают изменения структуры рецептора, отличающиеся от таковых, вызываемых агонистами и антагонистами (61). Была отмечена связь между структурой лиганд-рецепторного комплекса и конечным биолоическим действием. Эти исследования позволяют предположить возможность синтеза специфичных Пр-модуляторов, вызывающих различные конформации рецепторного белка и следовательно различные биологические эффекты.

Используя информацию, полученную из вышеописанных исследований, мы сформулировали рабочую гипотезу, объясняющую механизм, с помощью которого Пр различают связывающиеся с ними лиганды (рис. 12.4). Мы предполагаем, что карбоксильный конец Пр служит репрессором транскрипции. Взаимодействие с Пр агониста, антагониста или смешанного агониста приводит к различным конформационным изменениям рецепторного белка, которые в конечном итоге приводят к отщеплению белков теплового шока. Однако только агонист и в меньшей степени частичный агонист вызывают конформации, которые могут преодолеть ингибиторное влияние концевой части домена и привести к продуктивному взаимодействию рецептора с аппаратом транскрипции. Подтверждение этой гипотезы требует кристаллографической информации, однако наши наблюдения уже показали, что различные лиганды взаимодействуют с Пр различными путями и приводят к различным биологическим эффектам.

Основываясь на опубликованных данных и дополнительных данных, представленных в настоящем обзоре, мы предположили следующую рабочую гипотезу, объясняющую клеточный механизм различения агонистов и антагонистов Пр. В свободном состоянии Пр неактивны и взаимодействуют с репрессорными белками. Агонисты связываются с карбоксильным концом рецепторного белка и вызывают структурные изменения, активирующие рецептор, возможно путем удаления репрессорного белка и/или активации домена, связывающегося с ДНК. Антагонисты, связывающиеся с NH₂-концом гормон-связывающего домена, вызывают другое изменение конформации рецепторного белка, при котором карбоксильный конец не повернут к рецепторной части. Изменения, вызываемые антагонистами, могут быть недостаточны для удаления репрессорного белка или активации доменов связывания с ДНК. Смешанные агонисты могут связываться и с карбоксильной и с аминогруппой гормон-связывающего домена, вызывая новую конформацию, позволяющую рецептору проявлять некоторую активность, но не полноценно, например путем продолжающейся, но менее стабильной связи с репрессором.

Антагонисты эстрогеновых рецепторов

Некоторые из наиболее часто использующихся антиэстрогенов, как в терапии, так и в экспериментальной эндокринологии, показаны на рис. 2.5. По результатам экспериментов in vitro и in vivo, эти вещества были разделены на разные категории. Существуют как стероидные (ICI164,384), так и нестероидные антиэстрогены (тамоксифен) (16, 48, 63, 64). Антиэстроген ICI164,384 является стероидом и вначале создавался как активный лиганд Эр. Было показано, что добавление длинного алкильного радикала в положении 7альфа к стероидному ядру приводит к антиэстрогенной активности соединения. Свойства этого класса антиэстрогенов изучены достаточно широко, поскольку они являются первым классом, лишенным частичной эстрогенной активности. Другой класс широко используемых антиэстрогенов - трифенилэтилены (тамоксифен) и производные бензотиофена (ралоксифен). Эти вещества уникальны тем, что в большинстве тканей они являются антагонистами Эр, а в некоторых клетках и при определенных условиях проявляют частичную активность агонистов. В частности, эти вещества проявляют антиэстрогенную активность в отношении молочных желез и эстрогенную - в отношении костей и сердечно-сосудистой системы. Молекулярные основы этого феномена достаточно изучены и изложены в литературе (16, 41, 47, 48, 56, 65).

Стероидный антиэстроген ICI164,384 проявляет исключительно антиэстрогенную активность как in vitro, так in vivo. Предполагается, что ICI164, 384 блокирует функцию Эр, нарушая димеризацию (41, 63, 66). Однако данные об изменении эффективности связывания Эр с ДНК после взаимодействия с ICI164,384 противоречивы. Было показано, что стабильность Эр-димеров может колебаться в зависимости от клеточной локализации Эр (67) и от условий эксперимента, используемых для определения взаимодействия Эр-димеров с ДНК. Эти различия могут объяснить, почему некоторые исследователи не могут обнаружить какие-либо влияния ICI164,384 на взаимодействия Эр с ДНК (68). В отличие от ICI164,384, производные бензотиофена (ралоксифен) и трифенилэтилена (тамоксифен) способствуют взаимодействию Эр с ДНК. В большинстве случаев эта активность приводит к антиэстрогенной активности (16, 48, 65). Однако относительная выраженность свойств этих веществ как агонистов и антагонистов зависит от окружающих условий. На основании серии in vitro-экспериментов были сформулированы молекулярные критерии, позволяющие различать агонистов Эр и частичных агонистов, а также дополнительно классифицировать известные антагонисты Эр на три функциональных категории. Эффекты известных агонистов и антагонистов позволяет предположить, что эта классификация отражает различные изменения Эр, вызыванные лигандами. Схема этой классификации отражена на рис. 12.6. Было предположено, что Эр существует в состоянии, среднем между активной и неактивной формой, причем в отсутствии лиганда преобладает неактивная конформация. Взаимодействие Эр с 17-бета-эстрадиолом стабилизирует комплекс в конформации, активирующей транскрипцию. Относительная про-/антиэстрогенная активность других модуляторов Эр определяется промежуточными конформациями. Адаптируя принцип Klein-Hitpass et al, первоначально предложенный для классификации антипрогестинов, предложено назвать вещества, препятствующие взаимодействию Эр с ДНК, антиэстрогенами 1 типа (54). В отличие от 1 класса антипрогестинов, антиэстрогены 1 типа на сегодняшний день не идентифицированы. Основываясь на этой номенклатуре, предложено ICI164,384 отнести к антиэстрогенам 2 типа, вызывающим конформацию рецептора, наиболее близкую к неактивной. Ралоксифен, который может проявлять себя как антагонист и частичный агонист, в зависимости от условий, представляет собой 3 тип антиэстрогенов. Наконец, 4-ОН-тамоксифен представляет 4 тип антиэстрогенов, стабилизирующий Эр в наиболее активной конформации (16, 48). Со временем возможен синтез новых типов антагонистов Эр.

Эр существует в клетках в различных конформациях, представляющих неактивное, активное и ряд промежуточных состояний. Лиганды проявляют свои биологические свойства, стабилизируя Эр в одном из его конформационных состояний. Основываясь на номенклатуре Klein-Hitpass (54) и результатах наших исследований, мы подразделили известные антиэстрогены на различные классы, представленные ICI164,384 (тип 2), ралоксифеном (тип 3), 4-гидрокситамоксифеном (тип 4), соответственно. Хотя мы не можем продемонстрировать существование антиэстрогенов 1 типа (предотвращающих взаимодействие рецептора с ДНК), теоретически возможно, что эти вещества будут открыты.