Молекулярные подходы к созданию новых агонистов прогестероновых рецепторов
Были собраны клинические и эпидемиологические данные, описывающие терапевтическое и побочное действие натуральных и синтетических прогестинов. Используя молекулярный подход, мы попытались создать новое вещество нестероидной природы, активное при оральном приеме, оказывающее желательный терапевтический эффект прогестинов и не обладающий их побочными действиями. Молекулярные и клеточные методы исследования использовались для изучения лиганд-рецепторных взаимодействий, изучались клеточные изменения после транскрипционной активации прогестероновых рецепторов. Добивались высокой селективности, чтобы это вещество не связывалось с потенциальными мишенями существующих прогестинов - рецепторами к андрогенам, эстрогенам,…(GR, MR-?). Выделенные вещества апробировались на животных моделях. Полученное вещество не обладает перекрестной реактивностью с адрогеновыми, эстрогеновыми,… рецепторами, оказывает полноценное защитное действие на эндометрий в режиме ЗГТ у животных, полностью блокирует овуляцию, оказывает незначительное (или полностью не оказывает) пролиферативное влияние на ткань молочной железы. Не обладает нейротропным эффектом стероидов, не взаимодействует с рецепторами ГАМК-а, что предполагает минимальное действие на ЦНС. Т.о. создан новый класс нестероидных прогестинов, действие которых изучено на молекулярных, клеточных, животных моделях, которые обладают желательными свойствами прогестинов и не оказывают соответствующих побочных эффектов.
Ингибирование гибели клеток рака молочной железы под действием прогестинов
Ранее мы отмечали стимуляцию пролиферации и ингибирование гибели клеток рака молочной железы Т47D под действием прогестинов. Теперь мы обнаружили, что прогестины защищают клетки от гибели, вызываемой недостатком питательных веществ, и что антипрогестин RU486 блокирует этот процесс, эстрадиол 17-бета не стимулирует, несмотря на то, что усиливает пролиферацию. Тестостерон, дексаметазон, альдостерон не оказывают защитное действие. Прогестины также оказывают, а эстрадиол 17-бета не оказывает защитное действие в отношении клеток рака молочной железы MCF-7, MDA-MB-231. Более того, прогестины снижают уровень анти-апоптотического протеина bcl-2, повышают - bcl-xL и снижают - bad. Эстрогены стимулируют bcl-2, но не bcl-xL. Эти данные совпадают с идеей о том, что повышение уровня bcl-xL важнее, чем bcl-2, для защиты этих раковых клеток от гибели. Описанные данные могут объяснить недавние клинические исследования, показавшие, что у женщин в постменопаузе на фоне ЗГТ совместно прогестинами и эстрогенами риск развития рака молочной железы был выше, чем при изолированной эстрогенной терапии. И наконец мы обнаружили, что прогестины защищают клетки T47D от гибели, вызываемой химиотерапией доксорубицином.
Действие прогестерона на экспрессию факторов роста в миоме матки
Сегодня известно, что использование ЛНГ-ВМС эффективно для длительного лечения меноррагии у женщин с миомой матки. Недавно мы отметили, что эпидермальный и инсулиноподобный фактор роста-1 (ЭФР и ИПФР-1) играют важную роль в активации роста миомы, опосредуя влияние эстрогенов, стимулируя пролиферацию и ингибируя апоптоз клеток миомы. Эти находки сподвигли нас изучить эффект прогестерона на рост и апоптоз клеток лейомиомы матки in vitro. В настоящем исследовании мы оценили действие прогестерона на экспрессию факторов роста (ЭФР, ИПФР-1) и факторов, регулирующих апоптоз (ТНФ-альфа, протеин bcl-2) в культуре клеток лейомиомы. Наши результаты позволяют предположить, что прогестерон оказывает двойное действие на рост маточной лейомиомы: с одной стороны, он стимулирует рост клеток и выживаемость за счет повышения экспрессии ЭФР и bcl-2 протеина и снижения экспрессии ТНФ-альфа; с другой стороны, он ингибирует рост клеток лейомиомы за счет снижения экспрессии ИПФР-1. Эти данные могут объяснить, почему размеры миомы матки во время использования ЛНГ-ВМС в некоторых случаях увеличиваются, а в некоторых уменьшаются. Это также может объяснить, почему размеры миомы во время беременности не увеличиваются, несмотря на повышение концентрации половых стероидов.
Взаимосвязь структуры и функции у синтетических прогестинов
Целью этого обзора было:
1) создать обобщающую классификацию прогестинов;
2) изучить взаимосвязь между андрогенной и гестагенной активностью прогестинов;
3) связать эти свойства с метаболическими эффектами оральных контрацептивов (ОК).
Мы подразделили прогестины согласно их химической структуре: прегнаны, эстраны, ранние гонаны, поздние гонаны, гибридные прогестины, обладающие структурными и функциональными свойствами двух классов.Для создания более активного гестагена, чем эстраны, присоединение метильной группы в положение С18 к молекуле эстрана привело к синтезу ранних гонанов - d- и l-норгестрел. По аффинности к рецептору прогестерона (вытеснение 3Н-R5020 из связи с прогестероновым рецептором) левоноргестрел в 5 раз активнее прогестерона; однако его андрогенная активность выше в 44 раза (вытеснение 3Н-дигидротестостерона из связи с андрогеновым рецептором). Структурные модификации норгестрела привели к синтезу поздних гонанов, веществ с высокой гестагенной и сниженной андрогенной активностью. Прогестины из класса прегнанов не обладают андрогенной активностью, и некоторые из них являются антиандрогенами. Эстран диеногест и гибридный прогестин дроспиренон не имеют андрогенной активности. В комбинированных ОК прогестины нарушают метаболические эффекты эстрогенов. В этой статье мы изучали влияние на уровень холестерина ЛПВП. ОК, содержащие норэтиндрон, норгестимат, дезогестрел и ципротерона ацетат, значительно повышают содержание ЛПВП, а левоноргестрел достоверно снижает. Диеногест и дроспиренон не оказывают влияния на ЛПВП. Обсуждение затрагивает другие моменты метаболизма липидов и тромбогенный потенциал.
Экспрессия безлигандного прогестеронового рецептора В стимулирует инвазию раковых клеток в эндометрий
В клеточной линии рака эндометрия прогестерон регулирует экспрессию генов инвазии и метастазирования. В настоящем исследовании мы изучали способность клеток рака эндометрия экспрессировать различные изотипы прогестероновых рецепторов (ПР). Мы изучали экспрессию генов на клетках рака эндометрия линии Ishikawa, экспрессирующих различные изотипы ПР (ПРА и /или ПРВ). Было обнаружено, что в отсутствие прогестерона все клеточные линии, экспрессирующие ПРВ, экспрессируют Е-кадгерин и Р-кадгерин в значительно меньших количествах, чем клетки, экспрессирующие только ПРА или вообще не экспрессирующие ПР. Для оценки инвазивной способности различных клеточных линий, экспрессирующих ПР, производили инвазию in vitro. В отсутствие прогестерона, клеточные линии, экспрессирующие ПРВ, обладали значительно большей инвазивной способностью. Клеточные линии, экспрессирующие ПРА, обладали значительно меньшей инвазивной способностью. Для оценки метастатического потенциала клеточных линий, экспрессирующих различные ПР, использовали животную модель. Был сделан вывод, что прогестерон может блокировать инвазию раковых клеток эндометрия. Более того, мы предполагаем, что безлигандные ПРВ обладают проинвазивным действием на клетки рака эндометрия, возможно за счет подавления синтеза кадгеринов.
Антипрогестин-зависимая система включения генов для регулируемой генетической терапии
Антипрогестин-контролируемые системы регуляции генов, первоначально открытые O’Malley и соавт., основаны на необычных способностях усеченного лиганд-связывающего домена ПР (ПР-ЛСД). Этот модифицированный домен теряет способность отвечать на воздействие прогестинов, но приобретает активность воспринимать антипрогестины как агонисты, а не антагонисты. Когда измененный ПР-ЛСД соединяется со специфическим ДНК-связывающим и активирующим транскрипцию доменом, образуется транскрипционный фактор трансгенеза. Антипрогестин-индуцируемая регулирующая система генов ипользуется для регуляции трансгенной экспрессии в клетках in vitro, у трансгенных животных и в опытах in vivo по переносу генов с использованием вирусных или плазмидных векторов. Мы создали плазмидную, специфическую для скелетных мышц систему, включающую гены, которая, при введении в скелетные мышцы путем электрофореза, осуществляет регулируемую экспрессию эритропоэтина у мышей и крыс, обладая зависимостью от орального введения мифепристона. Регуляция оказывалась эффективной при низких дозах плазмид и мифепристона, оказывала биологическое действие (изменение гематокрита) на более чем 6 мес, и была применима к более крупным млекопитающим (собаки). Эта антипрогестин-индуцируемая система включения генов может рассматриваться как подходящая длительная и эффективная генетическая терапия анемии.
Фармакологические свойства CDB(VA)-2914
CDB(VA)-2914 - это синтетический стероид, демонстрирующий потенциальную активность антагониста прогестерона in vitro и in vivo. Он связывается с ПР с высокой аффинностью и действует, конкурентно связываясь с прогестерон-связывающим рецептором для ДНК с промотером гена-мишени. Его связывающая и антагонистическая активность относительно рецепторов к глюкокортикоидам значительно ниже, чем у мифепристона, что указывает на то, что CDB(VA)-2914 принадлежит к новому классу модуляторов ПР со сниженной антиглюкокортикоидной активностью. Фармакологические эффекты CDB(VA)-2914 исследовались на животных моделях. БЫло показано, что это вещество ингибирует пролиферацию эндометрия, оказывает антиутеротропное и антиандрогенное действие у крыс, не влияет на функцию коры надпочечников. CDB(VA)-2914 ингибирует овуляцию у крыс при однократном оральном приеме (дозозависимый эффект) и проявляет контрацептивное действие при длительном введении низких доз. CDB(VA)-2914 также показал на животных моделях эффективность в качестве посткоитальной контрацепции. Благодаря своему уникальному фармакологическому профилю, CDB(VA)-2914 является обещающим кандидатом для использования в контрацептивных целях, а также при лечении миомы матки и эндометриоза.
Регуляция за счет прогестероновых рецепторов А и В в клетках человеческого эндометрия
ПР экспресируются в виде двух различных изоформ - А и В. Исследовались локализация и функции этих изоформ в клетках человеческого эндометрия в течение менструального цикла и в клеточной культуре. Для изучения ПР-А и ПР-В - специфических генов мы исследовали амфирегулин, регулирующйся ПР-А и кальцитонин, регулирующийся ПР-А и ПР-В. Использовались специфические антитела против ПР-В и против обеих изоформ (Ab-6, Ab-8, Neomarkers) для ВестернБлот и иммунохимического анализа. Клетки эндометрия были отделены от эпителия и фибробластов и выдерживались в течение 8 дней. Агонист прогестинов R5020 (10-7M) добавляли in vitro через 3, 12 и 24 часов. Регуляция прогестерон-зависимых генов кальцитонина и амфирегулина изучалисьметодом ПЦР. ПР-А и ПР-В определялись в фолликулиновую и лютеиновую фазы методами ВестернБлот и иммуногистохимическим. На парафиновых срезах ткани эндометрия ПР-В больше экспрессируется в железах. С середины до конца лютеиновой фазы ПР-В не определяется. Обе изоформы определяются в эпителиоцитах и фибробластах после несколько дней выдерживания в культуре. Кальцитонин экспрессируется в эпителиальных клетках, обработанных R5020, за счет прогестерон-зависимой регуляции.
Эффекты онапристона на эндометрий в постменопаузе
Введение: антагонист прогестерона мифепристон (RU486) оказывает парадоксальный агонистический эффект на эндометрий в постменопаузе. Мы провели исследование для определения эффекта “чистого” антипрогестина онапристона (ZK 98 299) на эндометрий в постменопаузе.
Методы исследования: 17 женщин в постменопаузе (45-62 лет), принимали по 2 мг эстрадиола и либо плацебо (1 группа), либо 1 мг онапристона (2 группа), либо 10 мг онапристона (3 группа) в сутки в течение 56 дней. Осуществлялась биопсия эндометрия в последнюю неделю лечения и подвергалась гистологическому и иммуногистохимическому исследованиям для определения эстрогеновых рецепторов (ЭР, ЭР-1D5, Dako), прогестероновых рецепторов (ПР, PRICA, Abbott) и маркера клеточной пролиферации Ki 67 (Ki 67, Novocastra).
Результаты: ФСГ был снижен у всех 114 женщин, включенных в исследование, вследствие терапии эстрадиолом. Наблюдался дополнительный дозозависимый супрессивный эффект онапристона на уровень гонадотропинов. Биопсию эндометрия брали у 11 пациенток. Все образцы показали пролиферацию эндометрия. Похожий паттерн иммунореактивности ЭР, ПР и Ki 67 с расположением в железах и в строме, наблюдался во всех группах.
Заключение: онапристон (в дозах, использованных в настоящем исследовании) не оказывает агонистического действия на эндометрий в постменопаузе. Однако он обладает прямым эффектом на гипофиз, подавляя секрецию ФСГ и ЛГ.
Перевод Малярской М.М.