Диагностика инфекций. Что такое ПЦР? И может ли ПЦР ошибаться?

ПЦР – это очень удобный и точный метод диагностики в медицине.

ПЦР – это метод диагностики, который позволяет обнаружить фрагменты микроорганизма (вируса, бактерии, гриба) в материале (слюне, мазке, мокроте, крови, кале, моче и т.д.), полученном от пациента.

Для врачей крайне важно точно и уверенно знать, какой микроб проник в организм больного и вызвал заболевание. ПЦР хорошо помогает в этом.

Все биологические виды: растения, животные, микробы и т.д., - имеют гены – биологическую инструкцию по сборке. Эта инструкция, как правило, содержится в молекулах ДНК. У некоторых вирусов ДНК нет. Тогда эта инструкция зашифровывается в другой молекуле – РНК.

Для того чтобы построить организм, в том числе, бактерию или вирус, эту инструкцию нужно расшифровать, изготовить на ее основе белки и собрать новый организм.

У каждого организма эта инструкция своя. Свой уникальный шифр (в ДНК или РНК). Уникальная последовательность, свойственная только этому виду.

Последовательность эта задается нуклеотидами. Нуклеотидов в этом шифре всего четыре. Что в ДНК, что в РНК. Т.е. все живое, говоря языком программистов, имеет 4-значный код. В ДНК эти нуклеотиды обозначаются буквами АГТЦ. В РНК одна из букв меняется на У. Но мы не будем углубляться в биохимию молекул, а переведем это на язык простых цифр. И тогда получится, что все организмы зашифрованы цифрами 1,2,3 и 4. Все. Эти четыре цифры, четыре нуклеотида, меняя свою очередность на протяжении молекулы, создают неповторимый отпечаток для каждого организма. Т.е. у каждого организма есть некий код. Например, 111243332444113222424341323232323431 и т.д.

Для того чтобы точно определить микроб, достаточно последовательности из нескольких десятков, сотен или тысяч этих цифр (нуклеотидов). Эта последовательность будет уникальна лишь для одного вида биологических существ.

Как же врачи и ученые пользуются этим шифром для определения инфекции?

Прежде чем научиться определять микроба в лаборатории больницы, ученые находят уникальную для данного вируса или бактерии последовательность нуклеотидов.

На основе этой последовательности они синтезируют некое подобие дешифровщика, который называется праймер.

Что такое праймер?

Праймер – это зеркальное отображение кода микроорганизма. Например, нуклеотид А всегда отражается нуклеотидом Т. Или, переходя на цифры, отражением 1 будет 3, а отражением 2 будет 4.

Какая ошибка может быть допущена на этом этапе?

Например, неправильно подобранная последовательность нуклеотидов для праймера.

Праймер – это некое подобие биологического ключа, с помощью которого можно идентифицировать микроба. Это как бы ключ к некоему замку. И важно, чтобы ключ подходил только к одному замку, а не превратился в отмычку, которой можно открыть много дверей. Для лаборатории такая отмычка будет обозначать гипердиагностику, ошибку в диагнозе. Т.е. тест-система с праймером-отмычкой будет давать положительный сигнал «есть микроб» не только на тот микроорганизм, который ищут, но и на другие. Например, тест-система на вирус А будет говорить «есть вирус А» и в том случае, когда вместо вируса А есть вирус В или С. При этом В и С могут быть безобидными вирусами, а могут быть вирусами, вызывающими совершенно другую болезнь. Обычно это бывает, когда праймер слишком короткий.

Но если праймер подобран и синтезирован правильно, то тест-система будет реагировать только на вирус А и больше ни на что.

Таким образом, хорошая ПЦР тест-система является самым точным методом диагностики на данный момент. И теоретически, и практически. Если сделана правильно.

Может ли ПЦР найти микроба, которого нет у больного?

Может. В трех случаях. И все эти три случая – грубейшие ошибки.

Первый вариант мы разобрали выше – это неправильно подобранный или неправильно синтезированный (собранный) праймер.

Второй вариант ошибки – неправильные режимы.

Для того чтобы приборы в лаборатории могли идентифицировать результат анализа, необходимо произвести с материалом, полученным от пациента, некоторые действия.

Во-первых, очистить и подготовить для детекции, а во-вторых – размножить.

В образце, полученном от пациента, может содержаться очень мало микробов или их фрагментов. Чтобы приборы увидели эти фрагменты, их необходимо размножить.

Это называется амплификацией.

Амплификация состоит из цикла повторяющихся действий, для которых задаются строгие температурные и временные рамки. Количество самих циклов так же четко регламентируется.

Что происходит при амплификации?

Допустим, в нашей пробе, полученной от пациента, есть всего один уникальный фрагмент генома вируса А. Не сам вирус, а последовательность нуклеотидов. Обрывок ДНК или РНК.

Для того чтобы наши приборы могли увидеть наличие этого фрагмента, нам надо его размножить.

Это примерно как мы не можем заметить на земле одну песчинку. Но если насыпать рядом тысячи песчинок, то мы их легко заметим. А если насыпать соль, то мы сможем отличить горку соли, от горки песка.

Какая ошибка может возникнуть в процессе амплификации?

Если количество циклов, температура и время одного цикла подобраны неверно, то можно как не обнаружить геном вируса А, который есть, так и обнаружить геном вируса А, которого у больного нет.

Эти ошибки могут возникнуть из-за неправильного протокола исследования, т.е. это ошибка разработчиков, так и из-за неправильной работы лаборатории.

Кроме этого, возможен и ложно-положительный ответ.

Дело в том, что редко какой микроб может вызвать заболевание, если в организм попало мало болезнетворных микроорганизмов. Как правило, микробов должны быть сотни и даже тысячи. При этом они могут занимать очень мало места. Меньше, чем острие иголки. Но особенности ПЦР позволяют найти буквально одну вирусную частицу в образце, которая могла попасть туда не из пациента, а из воздуха, например.

Поэтому правильное количество циклов амплификации и режимы этих циклов очень важны для качественной диагностики.

Ошибка, которая может возникнуть в лаборатории, связана с тем же самым феноменом – воздух вокруг нас не стерилен. В нем всегда присутствует некоторое количество вирусов и бактерий, в том числе и болезнетворных.

Для того чтобы вызвать заболевание, их мало. Но для того, чтобы быть выявленными в ПЦР – достаточно. Поэтому крайне важна правильная работа с образцами в лаборатории и особая чистота, микробиологическая чистота в ПЦР-лаборатории.

Еще одна ошибка, которая может приводить к неправильным результатам ПЦР-анализа, связана с нарушением при взятии самого образца, например, мазка у пациента. Или взятие неправильного образца.

Например, если вирус или бактерия живет в верхних дыхательных путях, нет никакого смысла брать у пациента кровь на ПЦР-анализ этого возбудителя.

Кроме того, если нужно взять мазок на ПЦР, то важно не только место, откуда берут, но и то, как берут. Ведь если схалтурить, то в образце может просто не оказаться фрагментов микроба, который на самом деле в организме есть.

Еще одной особенностью ПЦР диагностики является то, что даже при полном соблюдении всех протоколов, может возникнуть ситуация, когда человек здоров, а фрагменты генома возбудителя в его пробах обнаруживаются.

Такая ситуация может возникнуть сразу после самовыздоровления или удачно проведенного лечения, когда жизнеспособных микробов в организме уже нет, но их фрагменты еще остались. Но такая же ситуация может быть и в случае, когда человек уже заражен и заболеет, но симптомов болезни еще нет. Ну и при бессимптомном течении болезни или при т.н. носительстве, подобная картина тоже возможна.

Так хороша ли ПЦР диагностика?

Не смотря на все перечисленные сложности, качественная диагностика методом ПЦР на данный момент является самой точной, самой чувствительной и лучшей для идентификации возбудителя заболевания. Точность и специфичность хороших ПЦР тест-систем составляет 95-99%. Причем, как правило, эти 1-5% неточностей – это человеческий фактор при заборе или подготовке образцов.

Чего же не может ПЦР?

ПЦР не может дать информации о том, реагирует ли человек на инфекцию или нет. Для этого существуют другие анализы, в которых определяются концентрации IgM и IgG в крови человека. Эти Ig – иммуноглобулины, антитела, т.е. специальные молекулы, которые организм вырабатывает в норме в ответ на попадание в него инфекции, в ответ на болезнь.

Проблемы с этим методом такие.

• Первое – он не столь специфичен, как ПЦР, поскольку организму выгодно, если у него есть один иммуноглобулин, который может помочь в борьбе с несколькими микробами. Либо иммуноглобулины к разным микробам настолько похожи, что тест-система не может их отличить. Таким образом, возможны перекрестные реакции. Т.е. ложно-положительный результат.

• Второе. Методы определения антител не столь чувствительны, как ПЦР. Антитела не размножишь, как микробный геном. Поэтому приходится ждать, пока организм наработает достаточное количество антител. Достаточное, чтобы приборы в лаборатории смогли заметить и зафиксировать их концентрацию.

• Третье. Организму нужно время, чтобы начать вырабатывать антитела. И начинает он делать это только после того, как микроб попал в организм. Достаточное для диагностики количество антител появляется только к концу первой, а то и второй недели болезни. А есть заболевания, где количество антител нарастает еще медленнее. Например, в течение нескольких месяцев.