Влияние эстрадиола на метаболизм влагалищного коллагена у женщин в постменопаузе со стрессовым недержанием мочи

S.Jackson, M.James, P.Abrams

Br J Obstet Gyn, 2002, Vol 109, pp 339-344

Введение

Настоящая работа - третья по счету публикация результатов двойного слепого плацебо-контролируемого исследования эффективности эстрогенной терапии. Ранее были опубликованы результаты влияния эстрогенов на уротелий и кровоток в сонной артерии. Коллаген, белок соединительной ткани, придающий ей прочность, вероятно, играет ключевую роль в развитии недержания мочи. Распространение волокон коллагена в стенке влагалища, парауретральной ткани и средней порции леватора заднего прохода позволяет этой мышце контролировать расположение проксимальной части уретры. У женщин со стрессовым недержанием мочи отмечается снижение синтеза коллагена и значительное снижение общего его количества, в том числе в коже, круглых связках матки, вагинальном эпителии и пузырно-влагалищной фасции. Versi et al также отмечают корреляцию между общим уровнем коллагена в коже и параметрами уродинамики.

В течение многих лет известно, что количество коллагена падает в периоде постменопаузы. Albright впервые отметил в 10941 г, что у женщин с постменопаузальным остеопорозом истонченная кожа, что может свидетельствовать о системной атрофии тканей, а также описал увеличение частоты случаев недержания мочи в постменопаузе. Постменопаузальную потерю коллагена костной ткани можно остановить с помощью заместительной терапии эстрогенами. Повышенная экскреция гидроксипролина с мочой после менопаузы полностью предотвращается с помощью терапии эстрогенами. Введение эстрогенов также предпочтительно в лечении постменопаузального стрессового недержания мочи, хотя мнения об этом показании противоречивы. Brincat et al отметили, что у женщин в постменопаузе, получавших эстрогены в форме имплантов в течение 2-10 лет, было на 48% больше коллагена в коже, чем у их ровесниц, не получавших ЗГТ. С другой стороны, Holland et al отметили, что хотя терапия эстрогенами в поздней постменопаузе предотвращает дальнейшую потерю коллагена, нет доказательств синтеза коллагена de novo: 12 месяцев терапии приводили к повышению стабильности коллагена за счет образования перекрестных сшивок между молекулами.

Существует 19 генетически различных типов коллагена, типы I и III являются основными структурными компонентами эпителиальной ткани. Волокна коллагена этих типов стабилизированы межмолекулярными ковалентными перекрестными связями, уровень сшивок дегидро-гидроксилизино-норлейцин (ГЛНЛ) и гидроксилизино-кето-норлейцин (ГЛКНЛ) обеспечивает стабильность молекулы, гистидино-гидроксилизино-норлейцин (ГГЛ) и гидроксилизил-пиридинолин - зрелость ткани. Зрелый, медленно метаболизирующийся коллаген подвержен неферментному гликированию, и продукты этой реакции образуют дополнительные перекрестные связи, затрудняющие деградацию коллагена. Равновесие между процессами синтеза и деградации внеклеточного матрикса важен для целостности ткани, поскольку ее ремоделирование происходит постоянно. Деградация зависит от общей активности матриксных металлопротеиназ (ММП) и катепсинов, выделяющихся различными типами клеток, в том числе клетками соединительной ткани. У человека идентифицировано 11 различных представителей семейства ММП, три из которых (ММП 1, 8 и 13) способны разрушать фибриллярный коллаген, а желатиназы (ММП 2 и 9) - получающиеся в результате денатурации коллагена пептиды. Активность этих ферментов зависит от продукции проферментов или активации или от изменения уровней их эндогенных ингибиторов.

Коллаген тазовой фасции возможно играет важную роль в патогенезе недержания мочи, ранее была высказана мысль о том, что стрессовое недержание мочи в пременопаузе связано, по крайней мере, частично, с повреждением метаболизма соединительной ткани.

Методы исследования

Мы предположили, что ЗГТ эстрогенами вызовет увеличение количества или качества тазового коллагена у женщин в постменопаузе. Однако тазовая фасция недоступна вне полостного вмешательства. Поскольку предыдущие исследования показали сходство коллагена влагалищной стенки с тазовой фасцией, возможно вызванного общим происхождением влагалища и нижних отделов мочевыводящих путей, мы использовали влагалищный источник коллагена для оценки эффекта эстрогенов. Первым измеряемым параметром было количество коллагена в соединительной ткани. Однако поскольку содержание коллагена и сила ткани зависит также от других факторов, таких как межмолекулярные перекрестные сшивки, генетический тип коллагена и активность матриксных металлопротеиназ, то мы измеряли и эти величины.

Точность содержания коллагена (погрешность) составила 5%, поскольку в обеих группах - с лечением и контрольной - наблюдалось снижение общего коллагена на 25-40%, и именно небольшие различия могли иметь клиническую значимость.

Клинические методы

В исследование были включены женщины в постменопаузе с уродинамическим диагнозом стрессовое недержание мочи. После получения информированного согласия образцы вагинального эпителия из периуретральной области массой 10-30 мг были взяты биопсийными щипцами Эппендорфа под местной анестезией 2,5% лидокаином и кремом с 2,5% прилокаином. Образцы ткани хранили при -80С.

Пациентки были рандомизированы на 2 группы: получающие 2 мг эстрадиола в сутки или плацебо. И пациентки и исследователи не знали состав даваемого средства. Поскольку вводили чистый эстроген, без прикрытия прогестинами, женщинам с интактной маткой проводили ультразвуковой контроль состояния эндометрия и при необходимости биопсию эндометрия. Через 6 мес терапии брали повторную вагинальную биопсию и сохраняли при -80С. После сбора всех образцов ткани проводили их биохимический анализ.

Биохимические методы

После приготовления срезов ткани толщиной 1 мм и обработки фосфатным буфером для удаления крови образцы высушивались и разделялись на три порции. Первую порцию использовали для определения общего содержания коллагена, перекрестных связей между молекулами и продукта гликирования - эту порцию гомогенизировали, выдерживали в фосфатном буфере (0,15 М хлорида натрия, 0,1М фосфата натрия, рН 7,4) и восстанавливали борогидридом натрия, как описано Light and Bailey - для стабилизации перекрестных связей и предотвращения их гидролиза в кислой среде. Далее образцы отмывали дистиллированной водой и замораживали в сухом виде для определения сухого веса. Полный вес (до высушивания) составлял 10-30 мг.

Общее содержание коллагена

Восстановленную борогидридом ткань гидролизовали в 6М растворе соляной кислоты в течение 24 ч при 112С, далее порции гидролизата анализировали на присутствие гидроксипролина с помощью автоанализатора Chemlab, согласно методике Bannister and Burns. Поскольку гидроксипролин составляет 14% сухого веса коллагена типов I и III, его содержание, умноженное на 7,14, позволяет точно оценить общее содержание коллагена.

Межмолекулярные связи

Образцы гидролизата замораживали в высушенном виде, удаляя соляную кислоту, затем регидратировали в деионизированной воде, после чего добавляли ледяную уксусную кислоту, а затем бутанол т.о., чтобы восстановленный образец имел соотношение бутанол: уксусная кислота: вода = 4: 1: 1 и общий объем 6 мл. Образцы пропускали через СF1 целлюлозную колонку для удаления не перекрестных аминокислотных остатков и затем анализировали с помощью LKB Alpha Plus аминокислотного анализатора, для отделения сшивок, как описано Sims and Bailey.

Продукты гликирования

Образцы гидролизата использовали одновременно для определения пиридинолина и конечного продукта гликирования - пентозидина. После замораживания в сухом виде гидролизат регидратировали в 100 мкл деионизированной воды, содержащей 1% трифторуксусную кислоту и фильтровали через 0,2 мкм-фильтр, а затем проводили ВЖХГ, как описано Bailey et al. Проводили хроматографию каждого образца на графитовой колонке Shandon Hypercarb S (4,6x100 мм). Интересующие продукты отмывались растворами 0,5% трифторуксусной кислоты и тетрагидрофурана с восходящей концентрацией от 0 до 12%. Естественная флюоресценция пиридинолина и пентозидина определялась с использованием флюориметра Perkin Elmer на 295Х/405М нм и 335Х/385М нм, соответственно.

Генетический тип коллагена

Образцы ткани выдерживали в растворе цианогена бромида в 10% муравьиной кислоте при 37С в течение 4 ч, как описано Light. Полученную смесь пептидов растворяли в натриевом додецил-сульфат-полиакриламидном геле и проводили электрофорез. Использовали буферные системы, описанные Laemmli. После электрофореза гель фиксировали и окрашивали на ночь раствором 0,1% PAGE blue 83 в 40% метаноле и 10% уксусной кислоты. После отмывания 7,5% уксусной кислотой и 5% метанолом гель сканировали с помощью лазерного денситометра LKB ultraskan XL и высчитывали количество пептидов альфа1(I)СВ8 и альфа1(III)СВ5.

Матриксные металлопротеиназы

Высушенные образцы ткани замораживали в жидком азоте и пульверизовали. Превращенную в порошок ткань экстрагировали с использованием 0,1% Brij 35, полученные образцы смешивали в отношении 1:2 по объему с невосстановленным буфером SDS и помещали в SDS-полиакриламидный гель (10%), кополимеризованный с желатином (0,5 мг/мл). Электрофорез проводили как описано ранее. После электрофореза SDS удаляли из геля путем отмывания 2,5% Triton X-100. Гель инкубировали в течение 18 ч в буфере, подходящем для протеолиза ММП (50 мМ Tris-HCl, 50 мMCaCl2, 0,8М NaCl, 1мМ аминофенил-ртути ацетат) для активации проферментов и миграции ферментов в желатин. Зоны протеолиза визуализировали окрашиванием желатина в геле с PAGE blue 83, количественную оценку ММП проводили с помощью денситометрии геля оптическим сканером.

Результаты

В исследовании приняли участие 67 женщин во временном промежутке с августа 1994 до октября 1996. Из них 55 провели влагалищную биопсию. Из них 27 вошли в группу плацебо и 28 - эстрогенов. Средний возраст составил 64 года в основной группе (51-74) и 62 в группе плацебо (49-73), средний возраст менопаузы - 13 (1-28) и 12 (1-24) лет, соответственно. 3 женщины выбыли из исследования: одна из-за смерти мужа, одна из-за дискомфорта во влагалище и одна по указанию лечащего врача из-за болей в грудной клетке. Еще трое отказались от повторной биопсии.

Т.о. полные данные были доступны у 49 пациенток, из которых 26 получали эстрогены и 23 - плацебо. Результаты исследования приведены в табл.1 По сравнению с группой плацебо в группе эстрогена произошло значительное снижение общего коллагена, ГГЛ (маркера зрелости) и конечного продукта гликирования NFC-1. Значительно повысился уровень незрелой сшивки ГЛКНЛ. Похожие изменения происходили и с другими параметрами: снижение маркера зрелости пиридинолина, продукта гликирования пентозидина и повышения ГЛНЛ, однако разница с группой плацебо не превысила 5%. Не было отмечено влияния эстрогена по сравнению с плацебо на отношение коллагенов I и III типов.

Результаты электрофореза, экспрессии ММП (проактивная ММП) и активности (активная ММП) представлены в табл. 2. Повышение экспрессии и активности ММП 2 и 9 были отчетливо видны на второй вагинальной биопсии, независимо от группы. Однако отмечена достоверная разница воздействия эстрогена по сравнению с плацебо в отношении экспрессии ММП-2, р=0,0017.

Обсуждение

Наши находки удивляют. Предшествующие неконтролируемые исследования отмечали более высокие уровни кожного коллагена при приеме ЗГТ в течение 2-10 лет женщинами в постменопаузе, что могло быть следствием повышения синтеза коллагена или ингибирования его потери. Наше исследование показало противоположные результаты: значительное снижение уровня коллагена после 6 мес терапии эстрогенами. Т.е. клинического улучшения состояния при лечении стрессового недержания мочи в постменопаузе эстрогенами не наблюдается. Интересно, что Falconer также отмечал похожую взаимосвязь между ЗГТ и снижением содержания коллагена в парауретральной ткани.

Снижение содержания коллагена связано с повышением протеиназной активности, повышением уровней и проактивной и активной форм ММП-2. Перед началом лечения экспрессия и активация ММП-2 были одинаковыми в основной и плацебо-группе. Поскольку ММП-9 в основном является маркером воспалительного процессе, неудивительно, что более значимый эффект за 6 мес эстрогены оказали на ММП-2, фермент, отражающий обновление ткани. Наблюдалось ткже повышение активности ММП при второй биопсии в группе плацебо, по неясной причине, однако, поскольку вторая биопсия бралась из того же места, что и первая, это повышение может быть свидетельством заживления и обновления поврежденной ткани. Однако повышение экспрессии ММП-2 и активации в основной группе достоверно выше, чем в группе плацебо. Создается впечатление, что эстрогены стимулируют деградацию коллагена путем повышения активности протеиназ.

Также создается впечатление повышенного синтеза нового коллагена в основной группе, ибо, хотя изменения отношения коллагенI/коллагенIII не происходит, но повышение уровня коллагена III свидетельствует о синтезе нового коллагена. Мы обнаружили повышение маркеров стабильности ГЛНЛ и ГЛКНЛрез 6 мес терапии эстрогенами, причем этот эффект не наблюдался в группе плацебо, и повышение ГЛКНЛ было статистически достоверно. Такое повышение свидетельствует об образовании нового коллагена. Со временем эти сшивки созревают в ГГЛ и пиридинолин, соответственно. Как и ожидалось, если старый коллаген деградирует и заменяется новым, концентрация ГГЛ и пиридинолина уменьшалась на фоне терапии эстрогенами, но статистически достоверное снижение произошло только у ГГЛ. Повышение ГГЛ в группе плацебо через 6 мес отражает процесс старения ткани.

Коллаген имеет длительный период полужизни и в течение времени присоединяет глюкозу - неферментативное гликирование ткани. Начальный продукт этой реакции может окисляться, образуя некоторые компоненты, называемые конечными продуктами гликирования. Присутствие этих продуктов является индикатором зрелости ткани. Наблюдаемое снижение конечных продуктов гликирования, NFC-1 и пентозидина, после терапии эстрогенами, поддерживает гипотезу повышенного обновления коллагена. Повышение уровня пентозидина в группе плацебо также связано со старением.

Перевод Малярской М.М.