Аутоантитела к 3-бетагидроксистероид дегидрогеназе редко встречаются при преждевременной яичниковой недостаточности

K.Reimand, P.Peterson, H.Hyoty et al

The J. of Clin. Endocrin&Metabolism, 2000, Vol. 85, No 6, рр 2324-2326

Преждевременная яичниковая недостаточность - это синдром, при котором менопауза наступает в возрасте до 40 лет. Это расстройство гетерогенной этиологии, в патогенезе которого могут играть роль такие факторы, как генетические или инфекционные. В качестве одной из возможных причин ПЯН предполагается аутоиммунный процесс, но его доля в структуре ПЯН до сих пор не определена. Гипотеза аутоиммунной причины ПЯН подтверждается его частой встречаемостью при других аутоиммунных эндокринных нарушениях, а также наличием у пациенток аутоантител к стероид-продуцирующим клеткам (СПК-АТ), особенно при сочетании с болезнью Аддисона, и лимфоцитарной инфильтрацией яичников, обнаруживаемой на гистологии. При реакции непрямой иммунофлюоресценции СПК-АТ реагируют с клетками, синтезирующими стероиды: коры надпочечников, теки интерны и желтого тела яичников, клетки Лейдига тестикул и плацентарные трофобласты. СПК-АТ обнаружены у 52% пациенток с ПЯН, в то же время другие исследователи обнаруживают их только у 1% пациенток.

В качестве молекулярных мишеней СПК-АТ описаны два фермента стероидогенеза: 17-альфа-гидроксилаза (Р450с17) и фермент, отщепляющий боковые цепи (Р450scc). Аутоантитела к З450с17 и Р450scc, а также к 21-гидроксилазе (Р450с21) - ферменту, экспрессирующемуся только в коре надпочечников, обнаружены в сыворотке пациенток с болезнью Аддисона при двух аутоиммунных полигландулярных синдромах (АПС). У пациентов с 1 типом АПС-1 имеются аутоантитела ко всем трем ферментам, а у пациентов с АПС2 и изолированной болезнью Аддисона преобладают аутоантитела к Р450с21. Обнаружение СПК-АТ при ПЯН, ассоциированном с болезнью Аддисона, и тесная связь этих болезней поддерживают гипотезу об общем патогенезе аутоиммунитета против надпочечников и яичников. Однако молекулярная природа аутоантигенов при ПЯН, не связанной с болезнью Аддисона (идиопатическая ПЯН), остается неизвестной.

Фермент 3-бета-гидроксистероид дегидрогеназа (3-бета ГСД) недавно охарактеризован как аутоантиген при ПЯН. Этот фермент вовлечен в стероидный обмен и экспрессируется на всех тканях, распознающих СПК-АТ. Для дальнейшего изучения этой реактивности мы определяли у пациентов с ПЯН, АПС1, АПС2, изолированной болезнью Аддисона, сахарным диабетом 1 типа (СД1) и здоровых людей из контрольной группы СПК-АТ методом ИФА и 3-бета-ГСД методом иммунопреципитации с транслированным in vitro антигеном. Мы также изучали реактивность сыворотки при ПЯН к двум другим специфическим аутоантигенам стероидных клеток: Р450с17 и Р450scc.

Материал и методы исследования

Образцы сыворотки

Образцы сыворотки от 48 пациенток из северной Англии (ср. возраст 36±11 лет, разброс от 17 до 67 лет) с ПЯН собирали в период 1992-1996 гг. ПЯН определяли на основании гипергонадотропной аменореи с сывороточными уровнями ЛГ и ФСГ более 10 МЕ/л, определенными как минимум дважды. У 30 пациенток не было обнаружено видимой причины ПЯН или других сочетающихся заболеваний, у 7 - ятрогенная или генетическая (синдром Тернера) этиология, у 11 - сочетающиеся аутоиммунные расстройства (болезнь Аддисона у 6, аутоиммунные поражения щитовидной железы у 5). Кроме того использовали сыворотку 15 финских пациентов с АПС-1, 9 финских пациентов с изолированной болезнью Аддисона, 28 финских пациентов с впервые диагностированным СД1. В качестве контроля использовали сыворотки 48 здоровых добровольцев из северной Англии и 23 - из Финляндии. От всех пациентов получено информированное согласие. Сыворотку хранили замороженной при -20С.

Непрямой иммунофлюоресцентный анализ

В качестве антигенного субстрата использовали человеческие надпочечники, плаценту, яичники, а также тестикулы макаки. Готовили срезы для криостата толщиной 6 мкм и инкубировали с тестируемой сывороткой в разведениях от 1:5 до 1:100, а затем обрабатывали иммунофлюоресцентными антителами (флюоресцирующий изотиоцианат-конъюгированный кроличий античеловеческий IgG).

Клонирование кДНК и трансляция in vitro

С-терминальный участок человеческой кДНК 3-бета-ГСД из 287 аминокислот связывали с N-концевой частью, амплифицировали методом ПЦР с 3-бета-ГСД специфическими праймерами, обрабатывали рестриктазами EcoRI, KnpI, формируя полную кДНК 3-бета-ГСД на векторе pGEM3. Оба образца - полную кДНК (pGEM3бетаГСД) и С-концевой фрагмент (pGEM3бетаГСДС) обрабатывали праймером Т7 для формирования правильной ориентации и рамки считывания кДНК. Гены pGEM3бетаГСД и pGEM3бетаГСДС, так же как pJEX17 и pJEXscc (клонированные Р450с17 и Р450scc) транскрибировали с помощью Т7 РНК-полимеразы и транслировали в ³⁵S-цистеин-меченный протеин. Затем продукт трансляции очищали на хроматографической колонне Сефадакс G-50 и анализировали с помощью ауторадиографии и SDS-PAGE.

Метод радиоиммунопреципитации

В каждом исследовании образец с транслированным протеином разводили в 50 мкл RIP-буфера (20 ммоль/л Tris, рН=8,0$ 150 ммоль/л хлорида натрия, 0,1% Triton X-100; 10 мкг/мл апротинина) и инкубировали с разведенной сывороткой (1:10 в RIP буфере) в течение 1 ч при комнатной температуре. 50 мкл Sepharose Fast Flow протеина, разведенного 1:5 в RIP-буфере добавляли и инкубировали в течение 1 ч при комнатной термпературе, встряхивая. Иммунные комплексы отмывали 4 раза с помощью центрифугирования, анализ проводили с помощью SDS-PAGE, а затем с помощью ауторадиографии.

Результаты

2 из 48 (4%) пациенток с ПЯН имели СПК-АТ в своей сыворотке, еще у 2 были антитела к коре надпочечников (КН-АТ). У обеих СПК-АТ-позитивных пациенток была болезнь Аддисона, так же как у 1 пациентки с КН-АТ. У второй пациентки с ПЯН и КН-АТ дополнительно было аутоиммунный гипотиреоз. СПК-АТ были обнаружены у 11 из 15 пациентов с АПС1 и у 1 из 9 с АПС2. У пациентов с изолированной болезнью Аддисона, СД1 и из контрольной группы не было СПК-АТ.

³⁵S-цистеин-меченные продукты генов pGEM3бетаГСД и pGEM3бетаГСДС имели, как и ожидалось, связанные участки весом весом 42 и 31 кДа, соответственно, при SDS-PAGE и ауторадиографии (рис. 1). В качестве положительного контроля кроличья антисыворотка против человеческой 3-бета ГСД четко распознала оба ³⁵S-цистеин-меченные продукта генов pGEM3бетаГСД и pGEM3бетаГСДС в реакции иммунопреципитации. Во время иммунопреципитации с человеческой сывороткой у 1 СПК-АТ позитивной пациентки с ПЯН происходила преципитация с 3бетаГСД-продуктом (1 из 41 идиопатической ПЯН, 2,4%). Другая СПК-АТ-позитивная сыворотка, так же как остальные сыворотки 46 пациенток с ПЯН оставались негативны. Кроме того, в 3 сыворотках из 15 от пациентов с АПС1, которые все были позитивны по СПК-АТ, реагировали с этим продуктом (20%). Ни одна сыворотка из 9 с АПС-2, 38 с изолированным синдромом Аддисона, 28 с СД 1 типа, 71 контрольных не была способна преципитировать с продуктом 3-бета-ГСД. При использовании для преципитации pGEM3бетаГСДС - продукта ни одного положительного связывания не было обнаружено при ауторадиографии, что показывает что эпитопы, необходимые для связывания аутоантител, локализованы в 86-аминокислотном N-концевом остатке протеина. Поскольку 10 АПС- и 1 АПС2 сывороток были позитивны по анти-Р450scc аутоантителам, сыворотки пациенток с ПЯН были проанализированы на присутствие этих антител. Однако никакой антительной реактивности этих образцов сыворотки с Р450с17 и Р450scc аутоантителами не наблюдалось.

Обсуждение

Аутоиммунная природа ПЯН предполагается в некоторых случаях, демонстрация ключевого аутоантигена является важным шагом в доказательстве этой гипотезы. Очевидно, что ПЯН может вызываться многими факторами, такими как генетические аномалии и инфекции, и различение истинной первичной аутоиммунной этиологии от вторичной, вызванной инфецкионными, ятрогенными генетическими факторами, очень затруднено. Недавно было открыто новое доказательство аутоиммунного механизма ПЯН - связь ПЯН с DQ-аллелями лейкоцитарных антигенов с аспартатом в позиции 57.

Недавний отчет об обнаружении аутоантител к стероидогенному ферменту 3-бета-ГСД, не принадлежащему семейству Р450, в относительно большом проценте случаев ПЯН (21%) было интригующим и предположило идиопатический компонент аутоиммунной яичниковой недостаточности, отличающийся от АПС1 и болезни Аддисона. Наши результаты показали однако, что присутствие аутоантитела к 3-бета-ГСД достаточно редко (2%) у пациенток с ПЯН. Напротив, мы обнаружили аутоантитела к 3-бетаГСД в даже более высоких концентрациях (20%) среди изучаемых пациентов с АПС-1. Интересно, что все 4 образца сыворотки, позитивной по анти 3-бета-ГСД антителам преципитировали с протеином полной длины, но не с С-концевым его полипептидом, что доказывает местонахождение иммунодоминантного эпитопа в N-концевой части 3-бета-ГСД. Общий эпитоп при 1 ПЯН и 3 АПС1, в свою очередь, отражает частичное присутствие обычных аутоиммунных механизмов в патогенезе ПЯН и АПС-1. Хотя имеющая дополнительно болезнь Аддисона 3-бета-ГСД-АТ- позитивная пациентка с ПЯН не может принадлежать к группам АПС-1 и АПС-2, поскольку не имела признаков кандидоза и гипопаратиреоза, а также СД1 или аутоиммунного гипотиреоза. Более того, не было обнаружено мутаций в ее ДНК в двух наиболее частых позициях (R257X, 1094-1106del) в аутоиммуно-регуляторном гене, вызывающем АПС-1.

В предыдущих исследованиях ни один из случаев ПЯН, позитивных по анти-3бетаГСД-АТ, не был ассоциирован с болезнью Аддисона, и только у 3 из 48 было аутоиммунное заболевание щитовидной железы, по сравнению с 6 и 5, соответственно, в нашем эксперименте. Пока непонятно как объяснить такую разницу в обнаруженной частоте 3-бета-ГСД-АТ, поскольку у 2 из 3 пациенток с ПЯН и гипотиреозом из первого исследования были 3-бета-ГСД-АТ, и большая часть пациентов в нашем исследовании с сопутствующими аутоиммунными расстройствами имела большую вероятность определения 3-бета-ГСД-АТ. Мы, кроме того, включили в исследование 7 пациенток с ПЯН ятрогенной или генетической этиологии, поскольку мы и другие авторы ранее обнаружили яичниковые антитела с помощью иммуносорбентного анализа у таких пациентов, повышающиеся после повреждения яичников, и нас интересовало, направлены ли эти яичниковые антитела напрямую против 3-бетаГСД. Мы не смогли обнаружить 3-бетаГСД-АТ у наших пациентов с СД1, хотя большой процент таких пациентов (23%) отмечался в предыдущем исследовании.

Поскольку ферменты Р450с7 и Р450scc известны как мишени СПК-АТ, мы изучали реактивность сыворотки пациенток с ПЯН с этими двумя ферментами. Ранее мы показали, что СПК-АТ в основном, если не всегда, наблюдаются при АПС-1, что приводит к их реактивности против этих двух ферментов. Все трое пациентов с АПС1 с 3-бетаГСД-АТ имели также антитела к Р45-с17 и Р450scc, но ни одна сыворотка больных ПЯН не преципитировала с этими ферментами. Отсутствие аутоантител к этим ферментами при ПЯН и АПС2 и наличие общего иммунного ответа в яичниковом и надпочечниковом аутоиммунитете предполагает наличие других аутоантигенов в стероидных клетках. Среди наших пациенток с ПЯН, сыворотки, СПК-АТ-позитивные, но 3-бетаГСД-негативные не обладали реактивностью против Р450с17 и Р450scc, что предполагает наличие еще нетипированных СПК.

Перевод Малярской М.М.