Аутоантитела к 3-бета-гидроксистероиддегидрогеназе у пациенток с идиопатической преждевременной яичниковой недостаточностью. N- и C- концевые эпитопы

S.Arif, R.Varela-Calvino, G.S.Conway, M.Peakman

J Clin Endocrinol & Metabolism, 2001, 86 (12):5892-5897

Преждевременная яичниковая недостаточность (ПЯН) - синдром, клинически определяемый как потеря яичниковой функции до 40 лет. Это гетерогенное расстройство с многофакторным патогенезом: хромосомные аномалии, генетические расстройства, нарушения обмена веществ, ятрогенные нарушения, инфекции. Однако у многих женщин этиология ПЯН до сих пор не известна, и для этих идиопатических случаев предположены аутоиммунные причины. Это предположение поддерживается гистологическими находками, демонстрирующими лимфоцитарную инфильтрацию яичников; присутствием аутоантител к антигенам яичников и сочетанием с другими аутоиммунными расстройствами. Антитела к стероидпродуцирующим клеткам (СПК-АТ), направленные напрямую против стероидных клеток коры надпочечников, теки интерны яичников, клеток Лейдига тестикул, плацентарного трофобласта - описаны при ПЯН с частотой встречаемости от 1 до 52%.

Ранее мы идентифицировали фермент стероидных клеток 3бета-гидроксистероид-дегидрогеназу (3бетаГСД) как аутоантиген при идиопатической ПЯН. Более того, у пациенток с ПЯН и аутоантителами к 3-бетаГСД имелся особый генотип HLA II класса - аспартатный остаток в 57 позиции бета-цепи DQ (HLA-DQb Asp⁵⁷). Эта демонстрация связи генотипа HLA II класса с аутоантителами к 3-бетаГСД поддерживает гипотезу аутоиммунного происхождения некоторых форм идиопатической ПЯН, поскольку такая ассоциация типична для других аутоиммунных расстройств.

В нашем оригинальном исследовании уровень аутоантител к 3-бетаГСД определяли с помощью метода иммуноблот. Формат исследования определял некоторые ограничения. Во-первых, антиген денатурирован, таким образом только линейные эпитопы доступны для связывания аутоантител. Аналитическая чувствительность и специфичность могут быть снижены при потере конформационных эпитопов. Во-вторых, анализ является скорее качественным, чем количественным.

Целью настоящего исследования было измерение уровня аутоантител методом иммунопреципитации меченного радиоактивным атомом нативного рекомбинантного 3бетаГСД, созданного в транскрипционно/трансляционной системе in vitro. Мы также постарались определить участки 3-бетаГСД, содержащие основные связывающие аутоантитела сайты.

Материал и методы исследования

В исследование было включено 100 пациенток с идиопатической ПЯН, обратившихся в Репродуктивную Эндокринологическую клинику в госпитале Миддлсекса (Лондон, Англия). Средний возраст 26 лет, разброс 11-39. ПЯН определяли как гипергонадотропную аменорею с сывороточными уровнями ЛГ и ФСГ более 20 МЕ/л двукратно. В нашей лаборатории верхнее референсное значение уровней ЛГ и ФСГ для женщин 11-29 лет составляет 10 МЕ/л, для женщин старше 30 лет - 15 МЕ/л. СПКЯ был исключен на основании клинических и ультразвуковых данных. Пациенты с ПЯН, развившейся вторично на фоне синдрома Тернера, химиотерапии, тазовой хирургии, облучения малого таза, галактоземии, генотипа 46,XY были исключены из исследования.

У 10 пациенток была первичная аменорея, у 90 - вторичная. Болезнь Аддисона исключали при клиническом обследовании, измерении электролитов сыворотки и с помощью пробы с синактеном. У 4 пациенток были аутоиммунные заболевания щитовидной железы, из них у 3 - гипотиреоз, получали лечение тироксином; у 1 - болезнь Грейвса.

В качестве контрольной группы сыворотку брали у 103 здоровых доноров женского пола (средний возраст 27 лет, разброс 18-43г).

Клонирование 3-бетаГСД

кДНК для человеческого 3-бетаГСД амплифицировали с помощью Pfu полимеразы в ПЦР со следующими праймерами верхней и нижней полоски: 5’GCTCTAGAGCCGCCACCATGGGCTGGAGCTGCCTTGTG 3’ и 5’GCTCTAGAGCTCACTGA GTCTTGGACTTCAGG 3‘, соответственно. Амплифицированный продукт обрабатывали XbaI и клонировали с pSP64 PolyA вектором. Для уточнения полученной последовательности проводили автоматический сиквенс с известными праймерами.

Формирование протеина люциферазы

кДНК человеческого 3-бетаГСД амплифицировали с помощью Pfu полимеразы в ПЦР со следующими праймерами верхней и нижней полоски: 5’GATCCTCATAAAGGCCATGGGCT GGAGCTGCCTTGTT3’ и 5’CCGCTCGAGTTAACCCACATGCACATCTC TGTC 3’, соответственно. Затем кДНК клонировали с ТОРО-ТА клонирующим вектором и обрабатывали EcoN1 и XhoI. Это вводило рамку считывания 3-бетаГСД в ген люциферазы в кодон 541, приводя к потере 9 терминальных кодонов люциферазы. Продукт pGEM-luc-3bHSD, его достоверность подтверждалась с помощью автоматического сиквенса.

Мечение эпитопов

Кроме введения целой молекулы 3бетаГСД в pGEM-luc, были созданы и клонированы в те же участки три фрагмента фермента, перекрывающиеся на 50 пар оснований: pGEM-luc-3bHSD^1-450 (число отражает пары оснований, соответствует 1-150 аминокислотам 3бетаГСД), pGEM-luc-3bHSD^399-849 (аминокислоты 133-283 3-бетаГСД) и pGEM-luc-3bHSD^798-1116 (аминокислоты 266-372). Фрагменты получали с помощью ПЦР-амплификации с Pfu полимеразой оригинальной кДНК3-бетаГСД, используя следующие пары праймеров: 5’GATCCTCATAAAGGCATGGGCTGGAGCTHCCTTGT 3’ и 5’CC GCTCGAGTTAGTTTTCCAGAGGCTCTTCTTC3’; 5’GATCCTCATAAAGGCCTCCTACAAGGAAATCATCCA 3’ и 5’CCGCTCGAGTTAGGAATC AAGGCGGAGGCCG 3’; 5’GATCCTCATAAAGGCCAACCTTAATTACACCC TGAGC 3’ и 5’CCGCTCGAGTTAACCCACATGCACATCTCTCTGTC 3’. Все три фрагмента подтверждены с помощью автоматического сиквенса.

Транскрипция и трансляция 3бетаГСД in vitro

Все продукты были транслированы и помечены радиоактивной меткой с помощью системы транскрипции/трансляции на кроличьих ретикулоцитах. Трансляцию проводили соответственно инструкции производителя, метили протеины либо ³⁵S-метионином, либо L-[4,5-³H]-лейцином в случае кДНК 3-бетаГСД, клонированной в pSP64, либо только ³⁵S-метионином для продуктов pGEM-luc. Вектор pGEM-luc также транслировали и получали контрольный протеин, меченный ³⁵S-метионином. Продукты трансляции изучали с помощью SDS-PAGE и ауторадиографии.

Радиоиммунопреципитация

Для каждого образца 17000-20000 cpm трансляционной смеси разводили до конечного объема 20 мкл в буфере для иммунопреципитации (10 ммоль HEPES (рН7,4), 0,5 ммоль метионина, 150 ммоль хлорида натрия, 10 ммоль бензамидина, 0.01% BSA, 0,5% Triton-X-114) и инкубировали с сывороткой до конечного разведения 1:5 в течение ночи при температуре 4С. 10 мкл Protein-A Sepharose (суспензия отмывалась дважды в буфере для иммунопреципитации и повторно разводилась в 0,5 мл буфера для преципитации на 1 мл Protein-A Sepharose) добавляли к каждому образцу и инкубировали при 4С в течение часа, встряхивая. Иммунные комплексы отмывали 5 раз в 0,5 мл буфера для иммунопреципитации, последнее отмывание производили в 0,5 мл стерильной воды, и анализировали с помощью SDS-PAGE и фосфовизуализатора. В каждый анализ добавляли контрольную кроличью антисыворотку к люциферазе и 3-бетаГСД. Также в каждый анализ добавляли сыворотку, позитивную по СПК-АТ и негативную контрольную сыворотку.

Количественный подсчет продукта иммунопреципитации с помощью фосфовизуализатора

Продукты преципитации разделяли в 10% SDS-PAGE, затем гель экспонировали в течение как минимум 48 часов, получали изображение, сканировали его и с помощью компьютерной программы измеряли интенсивность связывания.

Результаты

Выход меченого 3бетаГСД

В Табл. 1 показан средний уровень полученных меток. Выход протеина, меченного ³⁵S, из системы транскрипции/трансляции с pSP64 был очень мал, давая недостаточное количество для иммунопреципитационного анализа. В целом мечение считается достаточным для иммунопреципитации, если число меток как минимум в 5-10 раз выше, чем в негативной контрольной реакции. Мечение протеина с помощью L-[4,5-³H]-лейцина так же было недостаточным.

Для решения проблемы малого выхода 3бетаГСД клонировали с люциферазой, белком, мечение которого в этой системе доказанно достаточное. Продукт 3-бетаГСД-люцифераза имел ожидаемый размер 103 кДа на SDS-PAGE и преципитировался как 3-бетаГСД, так и люцифераза-специфическими антисыворотками, что показывает, что антигенные эпитопы обоих протеинов доступны для антител.

Уровень аутоантител, определяемых иммунопреципитацией

Транслированная и меченная радиоактивным изотопом смесь люцифераза-3бетаГСД использовались для определения аутоантител методом иммунопреципитации. Радиоактивность, связанная с иммунопреципитацией, определяемая по сцинтилляции жидкости, недостаточно чувствительна для различения позитивной и негативной сыворотки. По этой причине использовали более чувствительный подход, при котором продукты преципитации разводили в 10% SDS-PAGE, сравнивали с помощью компьютерной пограммы и оценивали количественно в сравнении с негативной контрольной сывороткой.

У 12 пациенток (12%) с идиопатической ПЯН были положительны аутоантитела к 3бетаГСД в этом анализе.

Ни одна из 103 контрольных сывороток не проявила какой-либо реактивности (рис.2), разница в частоте встречаемости аутоантител между пациентками и контрольной группой была достоверной (р<0,0001). Для убеждения в том, что реактивность была связана именно с 3бетаГСД, а не с люциферазной частью, все положительные образцы были протестированы с помощью иммунопреципитации на реактивность с люциферазой изолированно, и все тесты были негативными.

Сравнение методом иммунопреципитации и иммуноблота для определения уровня аутоантител к 3-бетаГСД

Ранее, используя метод иммуноблот, мы отметили присутствие аутоантител к 3бетаГСД у 25 из 118 (21%) пациенток с идиопатической ПЯН и у 5% здоровых лиц контрольной группы. Из этих 25 пациенток у 20 сыворотка была доступна для проведения метода иммунопреципитации. 14 из 20 сывороток, положительных при иммуноблоте, были негативны при иммунопреципитации, остальные же 6 сывороток были позитивны при обоих методах.

HLA-генотипы пациенток, позитивных по аутоантителам к 3-бетаГСД, определяемым методом иммунопреципитации

Система HLA представляет собой группу высоко полиморфичных генов на 6 хромосоме, вовлеченных в иммунную функцию. Ассоциации между аутоиммунными расстройствами, позитивностью по аутоантителам и подтипами HLA (например, ассоциация между HLA-DQ8, СД1, аутоантителами к декарбоксилазе глютаминовой кислоты) используются для подтверждения аутоиммунной природы заболевания. В наших предыдущих исследованиях генотип HLA-DQВ, кодирующий аспартат в позиции 57, был связан с ПЯН. В связи с этим мы обследовали частоту встречаемости этого генотипа в связи с аутоантителами, определяемыми новым методом.

Частота встречаемости HLA-DQb-Asp⁵⁷ была проанализирована у 12 пациенток, позитивных по аутоантителам к 3бетаГСД, определяемым методом иммунопреципитации. В этой когорте данные HLA были доступны у 11 из 12 пациенток, 10 из этих 11 (91%) были позитивны по генотипу HLA-DQb-Asp⁵⁷, более того, 2 из 10 (20%) были по нему гомозиготны. Ранее, при использовании метода иммуноблот, 18 из 21 (85%) пациенток оказывались позитивны по генотипу HLA-DQb-Asp⁵⁷. В контрольной популяции 92 пациентки из 134 (68%) были позитивны по генотипу HLA-DQb-Asp⁵⁷, из них 13% гомозиготны. При анализе методом “хи-квадрат” частота встречаемости генотипа HLA-DQb-Asp⁵⁷ достоверно не различалась между пациентками и контрольной группой.

Клинические характеристики пациенток, позитивных по аутоантителам к 3-бетаГСД

У 11 из 12 пациенток с аутоантителами к 3бетаГСД была вторичная аменорея, у 1 - первичная. Данные по тиреоидным и надпочечниковым аутоантителам были доступны у 11 из этих 12 пациенток. У 4 пациенток были тиреоидные аутоантитела ( у 1 к микросомам, у 1 к тиреоглобулину, у 2 оба вида антител), у 1 из них были клинические признаки гипотиреоза.

Мечение эпитопов

Тот же метод, что описан выше, использовался для определения аутоантител к каждому из трех фрагментов 3-бетаГСД, связанного с люциферазой. Сыворотка была доступна у 9 из 12 пациенток, позитивных по аутоантителам к 3бетаГСД.

На рис. 3 представлена реактивность каждого из трех фрагментов 3-бетаГСД с сывороткой пациенток с идиопатической ПЯН, позитивной по аутоантителам к 3-бетаГСД. Ни одна из сывороток не проявила какой-либо реактивности с фрагментом 2 (pGEM-luc-3bHSD^399-849). 2 сыворотки (22%) проявили реактивность к фрагменту 1 (pGEM-luc-3bHSD^1-450). 7 сывороток (77%) реагировали с фрагментом 3 (pGEM-luc-3bHSD^798-1116).

Из 5 пациенток, позитивных по аутоантителам к 3бетаГСД по результатам обоих методов, сыворотка одной показала реактивность с фрагментом 1 (N-концевым), 3 - с фрагментом 3 (С-концевым). Сыворотка одной пациентки реагировала с обоими фрагментами - 1 и 3.

Обсуждение

Целью настоящего исследования было определить аутоантитела к 3бетаГСД в сыворотке пациенток с ПЯН, используя количественный и чувствительный метод радиоиммунопреципитации. Дополнительной целью было определить, не сфокусирована ли реактивность избирательно на отдельных частях молекулы.

Вначале мы попытались пометить протеин 3бетаГСД, используя ³⁵S-метионин, L-[4,5-³H]-лейцин и широко используемую для транскрипции/трансляции in vitro плазмиду pSP64. Однако ни один из этих методов не привел к получению достаточного количества меченного протеина. По этой причине кДНК 3бетаГСД связали с люциферазой, что привело к образованию большого количества меченного протеина, распознающегося обоими антисыворотками - и к 3бетаГСД и к люциферазе. Люцифераза была выбрана для связывания, поскольку она очень эффективно транслируется и связывается с метками в системе транскрипции/трансляции in vitro. Это не первое исследование, где она так используется. Например, при болезни Грейвса, при которой антитела к рецептору ТТГ обычно присутствуют в низком уровне и с трудом определяются обычными методами, использование рецептора к ТТГ, связанного с люциферазой, в реакции иммунопреципитации дает положительные результаты, хорошо коррелирующие с уровнем связывания аутоантител, определяемым биохимическим анализом. Мечение 3бетаГСД с помощью ³⁵S-цистеина не подходит для настоящего исследования, так как одной из его целей является идентификация эпитопа 3бетаГСД, предпочтительно связывающего сыворотку пациентов. Отсутствие остатков цистеина в С-концевом участке (аминокислоты 260-372) не позволяют нам использовать радиоактивный цистеин. И наоборот, используя связь с хорошо поддающимся меткам протеином (люциферазой) позволило нам определить аутоантитела к любому участку 3бетаГСД, независимо от его аминокислотного состава.

Метод иммунопреципитации связанного протеина збетаГСД-люциферазы привел к определению аутоантител к 3 бета-ГСД у 12% пациенток с идиопатической ПЯН и ни у одной из обследованных нами здоровых женщин. Эти результаты позволяют предположить, что метод иммунопреципитации имеет большую специфичность, чем метод иммуноблот, который мы использовали ранее, при котором были позитивны 5% контрольных сывороток. Сравнительные результаты исследования сывороток обоими методами выявляют низкую конкордантность между ними, что отмечают и другие исследователи. Самое доступное объяснение низкой конкордантности между методами иммунопреципитации и иммуноблота - это природа антигена в этих исследованиях. В иммуноблоте 3бета-ГСД денатурирован кипячением, выдержан с химическими денатураторами и связан с нитроцеллюлозой. Это разрушает вторичную и третичную структуру белка, оставляя линейную молекулу. Связывание аутоантител с линейной молекулой зависит от их способности связываться с определенной аминокислотной последовательностью (линейные эпитопы). При иммунопреципитации антиген имеет нативную конформацию, сохраняя свою вторичную и третичную структуры. Многие типы аутоантител способны связываться именно с конформационными структурами (конформационные эпитопы) и не связывают линейные антигены. Наши результаты позволяют предположить, что в случае определения аутоантител к 3бетаГСД, антитела, связывающие линейные эпитопы, и выявляемые методом иммуноблот, менее специфичны, чем те, что связывают конформационные эпитопы и определяются методом иммунопреципитации.

Предыдущие исследования показало более редкую встречаемость аутоантител к 3бетаГСД у пациенток с ПЯН, чем мы определили сейчас. Этот разброс скорее всего является результатом методологических различий. В частности, система для определения связывания в нашем исследовании, была - фосфовизуализатор, что более чувствительно, чем ауторадиография, использованная Reimand et al. Кроме того, имеются различия в характеристиках пациентов в разных исследованиях. В частности, в нашем исследовании пациентки были более молодыми. Интересно, что Reimand et al отмечали присутствие аутоантител к 3 бетаГСД у 20% пациентов с аутоиммунным полиэндокринным синдромом 1, но неизвестно, была ли у кого-то из этих пациентов яичниковая недостаточность.

У пациенток с аутоантителами к 3бетаГСД в настоящем исследовании наблюдалась сильная взаимосвязь с генотипом HLA-DQb-Asp⁵⁷ - 90% по сравнению с 68% в контрольной популяции. Хотя эта разница статистически не достоверна, возможно причиной является недостаточная количественная выборка. Такие взаимосвязи между наличием аутоантител и определенным типом HLA-DQ наблюдается при других аутоиммунных расстройствах, таких как СД1, при которых аутоантитела к декарбоксилазе глютаминовой кислоты ассоциированы с генотипами DQ2/8 или DQ2/X. Взятые вместе, эти находки поддерживают вывод о том, что приблизительно 12% пациенток с идиопатической ПЯН имеют аутоиммунный патогенез своего заболевания. Однако в настоящее время не ясна роль аутоиммунитета к 3-бетаГСД в патогенезе заболевания. Дальнейшие исследования сконцентрированы на характеристиках аутоантител к этому фермент, но вряд ли аутоантитела сами собой вызывают повреждение ткани, поскольку 3бетаГСД также присутствует в тканях (например, кора надпочечников), не повреждающихся у пациенток с ПЯН. В настоящем исследовании мы использовали кДНК 3бетаГСД II типа как источник антигена, который в основном экспрессируется в надпочечниковой и яичниковой ткани. Возможно, что аутоантитела, которые мы определили, также перекрестно реагировали с вненадпочечниковым, I типом фермента, поскольку типы обладают 93% гомологией. Исходя из знаний о других аутоиммунных органоспецифических расстройствах, сопровождающихся аутоантителами к ферментам, дисфункция ферментативных процессов наблюдается редко.

Согласно результатам настоящего исследования, основной эпитоп для аутоантител к 3бетаГСД лежит в области аминокислотных последовательностей 1-150 и 266-372, участок 133-283 не обладает реактивностью. Все пациентки, положительные по аутоаттителам к 3-бетаГСД, демонстрируют реактивность по крайней мере к С- или N-концевой части. Возможно, что существуют другие эпитопы, но они непрерывны и требуют интактности молекулы. Другие исследователи отмечают, что иммунодоминантный регион молекулы 3бетаГСД находится в N-концевом участке, и настоящее исследование подтверждает этот вывод. Хотя каждый из фрагментов 3-бетаГСД преципитировал со специфичной к 3-бетаГСД антисывороткой, мы не можем исключить возможности того, что связь с люциферазой нарушает связывание с антителами и это приводит к сниженной реактивности N-концевого участка молекулы и к потере реактивности региона 133-283.

Перевод Малярской М.М.