Генотип HLA DQB1, кодирующий аспартат в позиции 57, связан с аутоиммунитетом к 3-бета-гидроксистероиддегидрогеназе при преждевременной яичниковой недостаточности

S.Arif, J.A.Underhill, P.Donaldson et al

J.Clin. Endocrinology&Metabolism, 1999,Vol 84, No3, pp 1056-1060

Введение

Преждевременная яичниковая недостаточность (ПЯН) - это потеря функции яичников до 40 лет, является важной причиной первичного и вторичного бесплодия. У многих женщин механизм ПЯН не объяснен, около 20% случаев идиопатической ПЯН приписывают аутоиммунный механизм развития. В пользу этой гипотезы служит наличие аутоантител против антигенов яичников, лимфоцитарная инфильтрация по результатам биопсии яичников и связь между развитием ПЯН и других аутоиммунных расстройств.

Одним из классов аутоантител, описанных при ПЯН, являются аутоантитела к стероидным клеткам, взаимодействующие с корой надпочечников, яичниками и тестикулами. Мы идентифицировали основную мишень АСК - фермент стероидных клеток 3-бета-гидроксистероиддегидрогеназа (3-бетаГСД), аутоантитела к этому ферменту обнаружены у 21% пациенток с идиопатической ПЯН. Мы предположили, что аутоантитела к 3-бета-ГСД могут быть маркером истинной аутоиммунной ПЯН и использоваться для подбора иммунной терапии пациенткам, предположительно наиболее к ней чувствительным. В настоящем исследовании мы искали дальнейших подтверждений тому, что наличие аутоантител к 3-бетаГСД определяют подгруппу ПЯН с аутоиммунным патогенезом. Многие известные органоспецифические аутоиммунные нарушения связаны с генами HLA 2класса. Продукты генов HLA 2 класса (участка хромосомы 6р21.3), включая те, что кодируют молекулы HLA-DR, -DQ, -DP. Эти гликопротеиды клеточной поверхности представляют собой пептидные антигены CD4+Т-хелперов и играют ключевую роль в иммунном ответе. Гены HLA -DR, -DQ, -DP обладают высокой степенью полиморфизма. Имеют множество различных аллельных форм, формируя молекулы с разными пептидо-связывающими свойствами. Мы определяли генотипы HLA DRB1, DQB1 когорте пациенток с идиопатической ПЯН, включая подгруппу пациенток с антителами к 3-бетаГСД как маркером аутоиммунной патологии.

Пациентки

В исследование были включены 118 женщин с идиопатической ПЯН (средний возраст наступления 26 лет, 11-39 лет). ПЯН определяли как гипергонадотропную аменорею с сывороточными уровнями ЛГ и ФСГ более 10 МЕ/л, измеренные дважды, и отсутствие менструаций в течение как минимум. Пациентки с синдромом Тернера, кастрационным синдромом, галактоземией и дисгенезией гонад 46, ХУ были исключены из исследования.

У 17 пациенток аменорея была первичная, у 101- вторичная. Болезни Аддисона не было ни у кого. У 4 пациенток была аутоиммунная патология щитовидной железы, из нх у 3 - гипотиреоз, корригируемый Л-тироксином, а у 1 - болезнь Грейвса.

Скрининг аутоантител

Аутоантитела к 3-бетаГСД измеряли методом вестернблот. Антитела к стероидпродуцирующим клеткам определяли с помонью непрямой иммунофлюоресценции на срезах надпочечников, тестикул и яичников обезьян. Аутоантитела к тиреоглобулину и тиреоидной пероксидазе определяли с помощью агглютинации в геле.

HLA-типирование

Аллели 32 антигенов HLA класса 2 DRB1, DQB1 определяли с помощью ПЦР-амплификации. Контрольную группу составили 134 женщины из тех же географических областей, что пациентки с ПЯН. В отсутствии генеалогических сведений невозможно было определить истинные гаплотипы, т.о определяли только избранные.

Результаты

Из 118 пациенток с ПЯН, участвовавших в исследовании, ДНК образцы были доступны у всех, образцы сыворотки - у 97 пациенток.

В начале мы сравнивали частоту генотипов HLA DR и DQ у пациенток с ПЯН и контрольной группы. Единственным достоверным различием было повышение частоты встречаемости генотипа DRB1*1101/3 у пациенток с ПЯН (хи квадрат=8,0, р < 0,0047). Повышение частоты встречаемости DQB1*0603 и 0301 также отмечалось (хи квадрат =4,2 и 5,03, соответственно, р = 0,041 и 0.025, соответственно), а также снижение частоты встречаемости генотипа DQB1*0302.

Когда пациенток разделили на группы с и без антител к 3-бетаГСД (Табл. 1 и 2), наметились явные тенденции. У 21 из 97 (21,6%) пациенток были аутоантитела к 3-бетаГСД. У пациенток с ПЯН и антителами к 3-бетаГСД была повышена частота встречаемости аллелей DQB1*0603 (25%) и 0301 (42,9%) по сравнению с контрольной группой (6,0% и 33,6%, соответственно; хи-квадрат=7,5 и 4,3; р=0,006 и 0,037, соответственно. Повышение частоты встречаемости генотипа DQB1*0301 сочеталось со значительно более высокой частотой гаплотипа DRB1*04/DQB1*0301, который был представлен у 9 пациенток (21,4% из возможных гаплотипов) с аутоантителами к 3-бетаГСД и только у 20 женщин контрольной грппы (7,5%, хи-квадрат=8,35, р=0,0039).

Анализ 57 позиции цепи DQ-бета

Повышение частоты встречаемости генотипов DQB1*0603 и 0301 у пациенток с ауотанителами к 3-бетаГСД, а также снижение частоты встречаемости DQB1*0302 особенно интересно при анализе аминокислотной последовательности DQ-бета цепей.

Помимо участков полиморфизма в локусе DQB1 GQB1*0603 и -0301 кодируют идентичные аминокислотные остатки в позициях 14, 38, 57, 71, 74-75, 77 и 116. Единственное положение, отличающееся от DQB1*0302 - это позиция 57. В аллелях 063 и 0301 эта позиция занята аспартатом, а в аллеле 0302 - аланином. Имея это в виду, мы определяли частоту DQ-бета-Asp⁵⁷-кодирующих генов, а именно: DQB1*0301, 0303, 0402, 0503, 0601-3 (DQB1*0203, 0401, 0306, 0607, 0611, 0614) - табл. 3 Частота DQбета-Asp⁵⁷-кодирующих генов у пациенток с аутоантителами к 3-бета-ГСД составила 7 из 42 гаплотипов по сравнению со 109 из 268 в контрольной группе (хи квадрат=8,2, р = 0,004) и 9 из 21 (48%) пациенток были гомозиготными по сравнению с 17 из 134 (12,7%) в контрольной группе (хи квадрат=11,8, р=0,0006).

Напротив, распределение гаплотипов DRB1 и DQB1 у пациенток с ПЯН, негативных по аутоантителам 3-бетаГСД, совпадало с таковым в контрольной группе, с 1 исключением. В негативной по аутоантителам группе была аномально повышена частота гаплотипа DR11-DQB1*0301 - у 76 (21%) по сравнению с 16 из 134 (11,9%) контрольной группы (хи-квадрат=9,5, р= 0,002).

Аутоантитела к тироидным антигенам и стероидпродуцирующим клеткам

Аутоантитела к стероидпродуцирующим клеткам обнаружились у 4 пациенток - к 3-бетаГСД (в зонах клубочковй и пучковой) - но не к 21-альфа-гидроксилазе (во всех трех зонах). Антитела к яичниковой ткани присутствовали у 1 пациентки. Частота аутоантител к тироидным микросомам и тиреоглобулину соответствовала описанной ранее. Ни у одной пациентки контрольной группе таких антител не было.

Принятие этих аутоантител как маркеров аутоиммуннитета у пациенток с ПЯН не повысило значимость какой-либо ассоциации HLA.

Обсуждение

В настоящем исследовании мы изучали распределение генотипов HLA-DRB1 и DQB1 у пациенток с идиопатической ПЯН, у которых мы также определяли аутоантитела к ферменту стероидпродуцирующих клеток - 3-бетаГСД. Целью исследования было оценить взаимосвязь между аутоиммунитетом к 3-бетаГСД и определенными генотипами HLA-DRB1 и HLA-DQB1, чтоб пролить свет на возможную роль этого фермента в патогенезе яичниковой недостаточности. Наши результаты показали, что генотипы DQB1*0301 и -0603 чаще обнаруживаются у пациенток с ПЯН и аутоантителами к 3-бетаГСД. Мы показали, что у пациенток с ПЯН, имеющих аутоантитела к 3-бетаГСД, чаще имеются гены DQбета-цепи, кодирующие аспартат в 57 позиции, и чаще, чем у женщин контрольной группы, определяется гомозиготность по этим генам.

Молекулы HLA 2 класса, DR и DQ являются гетеродимерами, каждый из которых состоит из альфа- и бета-цепей, приблизительно 29-34 кДа. Гетеродимеры формируют комплексы с короткими пептидами (13-24 аминокислоты), образующихся в результате ферментативного процессинга экзогенных или аутоантигенов. Пептиды связываются со специальными связывающими участками, затем комплекс молекула/пептид экспрессируется на поверхности антиген-презентирующей клетки для презентации антиегн-специфическим рецепторам на CD4+ Т-хелперах. Между людьми антигены HLA 2 класса обладают выраженным полиморфизмом, что приводит к вариабельности специфических аминокислотнх остатков в антиген-связывающих участков. Это оказывает влияние на степень связывания пептидов, которое, в свою очередь, влияет на созревание и периферическую активацию Т-клеток, хотя пока еще точно не известно, как эти события способствуют развитию аутоиммунной патологии.

Многие известные аутоиммунные расстройства связаны с генотипом HLA - генами HLA-DRB1 и HLA-DQB1: инсулнзависимый сахарный диабет (DQB1*0302), целиакия (DQB1*0201), буллезный пемфигоид (DQB1*0301), аутоиммунный гепатит (DRB1 гены, кодирующие лизин в позиции 71 DR-бета-цепи). 57 позиция HLA-DR занимает ключевое положение в связывающем участке. Аспартат в позиции 57 способствует формированию мостика с аргинином в позиции 76 альфа-цепи, а в отсутствии аспартата в этом положении такая конформация невозможна. Это единственное аминокислотное различие оказывает значительное влияние на степень связывания пептидов, а следовательно - на иммунный ответ.

Предыдущие исследования также пытались определить HLA-ассоциации с ПЯН. Наше исследование на небольшой группе пациенток (19 человек) отметило взаимосвязь между HLA-DR3, обнаруженным у 48% пациенток (по сравнению с 23% в контроле), другие исследователи обнаружили слабую связь с HLA-DR4, а еще одни - отсутствие всякой взаимосвязи. Каждое исследование базировалось на серологическом определении HLA-DR, и ни одно не включало подгруппу пациенток с аутоантителами. Серологическое исследование дает менее достоверные результаты, чем ДНК-техника, использовавшаяся в настоящем исследовании, и не позволяет различить основные аллели HLA-DQB1.

Интересно, что высокая частота встречаемости генов HLA-DRB1*1101/3, которую мы зафиксировали у наших пациенток, была именно у тех пациенток, у которых отсутствовали аутоантитела к 3-бетаГСД. Мы рискуем предположить, что пациенты с генотипом DRB1*11 могут образовывать другую подгруппу пациенток с аутоиммунной ПЯН, у которых мишень воздействия аутоантител не является 3-бета-ГСД

Перевод Малярской М.М.